周波数波長多重光音響断層撮影 - 株式会社アジャイルホライゾンパートナーズグループ

Nature Communications volume 13、記事番号: 4448 (2022) この記事を引用

2656 アクセス

3 引用

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

光音響 (OA) は、励起光エネルギー過渡現象を最大化することで高い S/N 比を達成するために、圧倒的にタイムドメイン (TD) で実装されます。周波数領域 (FD) での実装が提案されていますが、信号対雑音比が低いという問題があり、高度な普及を達成するために時間領域の方法と比較して競争上の利点を提供することはできませんでした。したがって、TD が光音響学を実行する最適な方法であると一般に信じられています。ここでは、パルス列照射と周波数領域多重化に基づく光音響概念を導入し、時間領域と比較してこのアプローチの優れたメリットを理論的に実証します。次に、レーザーダイオード照明の最近の進歩を利用して、複数の波長で周波数波長多重光音響トモグラフィー (FWMOT) を開始し、FWMOT がどのようにファントムおよび空間内で時間領域法によるスペクトル測定の S/N 比を最適化するかを実験的に示します。生体内。さらに、FWMOT が光音響学でこれまでに実証された中で最速のマルチスペクトル動作を提供することもわかりました。

光音響（OA）信号の生成には、エネルギー過渡現象によるサンプルの照明（パルスまたは正弦波照明など）が必要です1。サンプルはこの時間変化するエネルギーを吸収し、その後熱弾性膨張によって音波を生成します2。タイムドメイン（TD）OA 実装は、光音響信号生成に必要な熱および応力閉じ込めの制限を満たすために、ナノ秒持続時間の光パルス 3、4、5、6 によって大きなエネルギー過渡現象を提供します 7。また、ナノ秒持続パルスはエネルギー過渡を最大化し、信号対雑音比 (SNR) を最適化するため、TD は光音響学で選択される領域になります 8、9、10。 TD 光音響イメージングは、高感度の超音波トランスデューサーを使用して、調査対象の物体の表面上の複数の位置で生成された超音波 (US) の飛行時間を記録し、数学的逆変換を使用して、これらの測定値を 3 次元マップに変換します。光吸収１１．

光コヒーレンストモグラフィー (OCT) や磁気共鳴画像法 (MRI) などの他のイメージングモダリティは、当初 TD で実証されましたが、周波数領域 (FD) への切り替え操作によりイメージング速度と SNR の点で恩恵を受けています 12,13 。周波数領域（FD）光音響学も、個別の周波数で照明強度を変調し、同じ周波数で生成された OA 信号を検出することにより、TD の代替手段として検討されています 14、15、16。信号検出は、OA 信号の振幅と位相を取得する復調技術を使用して実現されます。この技術は、TD 検出で一般的である数十 MHz のサンプリングレートで時間信号を記録するよりも簡単で経済的です。 FD は、異なる色の光源を異なる周波数で変調することにより、複数の波長での同時照明も可能にします17、18、19。これらの利点にもかかわらず、強度変調光14、15、16は、TDで使用される超短パルスよりも6桁も弱い19エネルギー過渡現象と対応する光音響信号を提供し、FDのSNRを大幅に低下させます20、21、22。さらに、単一周波数での光音響調査では、深さ情報を収集できず、3 次元イメージングにもつながりません。我々は最近、深度情報と三次元画像再構成には複数の離散周波数での信号の生成が必要であることを示しました23。この要件は、複雑な放射（変調）および検出（復調）スキームにつながります23、24。したがって、TD17、18、19、23、24 に比べて潜在的な利点があるにもかかわらず、FD は光音響学の分野ではほとんど影響を与えていません。周波数チャープは、連続的に変化する周波数で光を変調し、時間を周波数でエンコードすることにより、ハイブリッド TD-FD 法としても研究されています。検出は、時間相関技術を使用して TD で実行されます。ただし、FD 法と同様に、正弦波を使用すると達成される SNR が制限されるため、チャープアプローチの使用は実験的調査に制限されます。

ここでは、FD の欠点を最小限に抑えながら、TD のパフォーマンスを確実に向上させる周波数波長多重 (FWM) 動作を提案します。 FWM は事実上、チャープ光音響の逆の実装であり、TD 光音響で採用されているものと同様の離散パルス列を使用しますが、結果として生じる離散周波数を処理して FD23 に現れ、その応答はで見られる周波数コムの出現に類似しています。スペクトル周波数。本明細書に示すように、ＦＷＭ照明はまた、イメージング時間を増加させることなく複数の波長での同時照明を可能にし、ＴＤシステムと比較して、使用される波長数Ｎの平方根だけ増加するＳＮＲ利得をもたらす。理論的考察に続いて、我々は、固体レーザーのより安価でより実用的な代替品を提供するオーバードライブレーザーダイオード26がFWMパルス列を活用し、TD実装を超える利点を実証できる高品質の光音響イメージングにつながる可能性があると仮説を立てました。我々は、4 つの同時にパルスを発生するオーバードライブレーザーダイオードを利用する周波数波長多重光音響トモグラフィー (FWMOT) システムを導入します。各レーザーダイオードは、異なる波長をエンコードするためにわずかに異なる繰り返しレートを利用します。これらの波長は、周波数領域内の異なる離散周波数に現れます。我々は、高い SNR でマウスのリンパと微小血管の動態を同時に多波長でメソスコピック 27 イメージングすることを示し、光音響学の分野でこれまでに達成された最速の多波長照明を提供し、TD の実装により向上するスペクトル性能を確認します。

従来のTD動作では、持続時間tpの方形光パルス（図1a）は、フーリエ変換を介して、最初のノードが1/tp周波数であるFD内に連続周波数スペクトルを生成します。 FD 動作では、TD 内の正弦波によって変調された光 (図 1b) により、FD 内に単一の離散周波数が生成されます。周波数波長多重変調では、代わりに、パルス幅 tp と繰り返し率 frep のパルス列 (図 1c) が考慮されます。このパルス列のフーリエ変換により、持続時間 tp の単一パルスの連続スペクトル (図 1a、右) と同じエンベロープ (図 1c、右) を持つ多くの離散周波数が得られます。パルス列の離散周波数は、基本繰返し周波数 frep、つまり frep の整数倍の高調波です。繰り返し率が高くなると、TD のパルス数が増加し、FD の離散ピークが減少します (図 1d)。 FDでは、パルス幅が長いと、最初のノード（1 / tp）が低周波数で現れ（図1e）、高周波数での全体のエネルギー密度が低下し、空間解像度が低下します28。

a TD の tp 期間の単一励起光パルス (左) と FD (右) の周波数の連続スペクトル。 b TD と FD には周波数 f の正弦波、TD には連続波、FD には単一の離散ピーク。 c TD および FD におけるパルス幅 tp および繰り返しレート frep のパルス列。 TD の多くの離散パルスと FD の多くの離散周波数は、a の tp 期間の単一パルスと同じエンベロープを持ちます。 d TD および FD におけるパルス幅 tp および繰り返し率 2frep のパルス列。 c と比較して、TD のパルス数は 2 倍ですが、FD の離散周波数の数は半分です。 e TD および FD におけるパルス幅 2tp、繰り返し率 2frep のパルス列。 TD には d と同じ数のパルスがあり、FD には離散周波数がありますが、(a) または (c) とは異なるエンベロープに従います。 f たとえば、異なる期間を示す 1、2、3、… などの (c) のようなパルス列を使用して記録された生の光音響信号。 g、h は TD での通常の平均化を示します。 g パルス列は、1、2、3、…で示される周期 T = 1/frep のセクションに分割され、ポイントごとに平均 (h) されます。 i、j 同じ信号の周波数波長多重処理。 i すべての基本繰り返しレート frep の高調波 (k * frep、k の正の整数) である多くの離散周波数を持つ生の光音響信号 (f) のフーリエ変換。 FD では、frep の高調波のみを選択し、ノイズ (j) のみを含む他の周波数をすべて破棄します。 k j で逆フーリエ変換を実行することにより、h の信号と完全に一致する TD 信号を復元します。

FWMスキームの実験的検証は、L1のみを使用してペトリ皿上の黒色ワニス層を励起することによって実行されました（図1f、g）。 TD で平均化すると (図 1g、h)、SNR が \(\scriptstyle{\sqrt{{N}_{{{{{\rm{p}}}}}}}\) 倍増加します。 Np はパルス列内のパルスの数です。対照的に、提案された FWM 方法は、次の操作を実行することにより、基本周波数 frep とその高調波 k * frep (k は整数) を選択します (図 1i) (補足注 1 を参照)。

ここで、Sa（ω）は平均化された信号のフーリエ変換、Sr（ω）は記録された信号（図1f）のフーリエ変換、Nhは検出された超音波トランスデューサーの帯域幅内の高調波の数、およびω0 = 2π/Tです。 OA 信号は、励起 LD パルス列に含まれる周波数とまったく同じ周波数で生成されます。したがって、操作 (1) では、frep の高調波のみが選択され、信号を含まない周波数がフィルタリングされて除去され、同じ係数で SNR が向上します \(\scriptstyle{\sqrt{{N}_{{{{{\rm{p }}}}}}}}\) TD と同様 (図 1j)。図 1j の信号は図 1h の信号のフーリエ変換であり、2 つの信号は完全に一致しています (図 1k)。この分析により、FWM 照明により、正確な FD 動作に必要な複数の離散周波数が実際に生成され、単一波長を使用した場合の TD と同等の SNR が得られることが確認されました。したがって、FWM 解析は通常の時間平均化と同等のフーリエ空間です。次に、複数の波長が使用される場合、FWM が TD よりも利点があることを示します。

TD に対する FWM の利点 (図 2) を実証するために、TD の単一波長励起パターンとそのパワースペクトルをフーリエ空間にプロットしました (図 2a)。これは、以下の解析の参考として役立ちます。図示のパルス列は、繰り返し率 frep = 1/T、パルスの総数 Np、パルス幅 tp、取得時間 tacq = Np × T に対応する周期 T を持ちます。周期 T は最大深度を定義します。 - 選択したパルス列で達成できる DoV = vs × T を表示します。ここで、vs は音速です。

a 周期 T、繰り返し率 frep = 1/T の 1 波長のパルス列。時間領域 (TD、左) とフーリエ領域 (右) で Np 個のパルスと取得時間 tacq を持ち、k frep は k の frep の高調波です。整数。 b–d TD 光音響 (OA) における複数の波長励起。 b 時間シフト T/4、すべての波長に対する Np パルス、および tacq 取得時間を持つ同じ繰り返しレート frep で発光する 4 つの波長の励起パターン。 c frep/4 繰り返し率、各波長の Np/4 パルス、および tacq 取得時間による 4 つの波長の励起パターン。 d frep/4 繰り返し率、波長あたり Np パルス、ただし取得時間は 4tacq の 4 つの波長の励起パターン。 e FWMOT 励起では、4 つの波長すべてが異なる繰り返しレート frep,1、frep,2、frep,3、frep,4、各波長および tacq 取得時間の Np パルスを持ちます。 f – j それぞれ（a – e）の励起パターンからペトリ皿上の黒色ワニス層によって記録されたOA信号。信号対ノイズ比 (SNR) とノイズレベルがすべてのケースに挿入されます。 f α、トリガーされたときのレーザーダイオード回路からの電磁干渉、β 黒色ニスからの OA 信号、γ シャーレまたは超音波トランスデューサーの音響レンズにおける OA 信号の反射。 g すべての波長の励起パターン b からの OA 信号 (上の線) は、各波長からの OA 信号 (下の線) の合計であり、各波長の視野深度 (DoV) が大幅に減少しています。各波長のレーザー干渉、OA 信号およびその反射 (α、β、γ) が表示されます。 h 各波長の OA 信号の SNR が低下しています。 i OA 信号の SNR は同じですが、取得時間が長くなります。 j 4 つの波長すべてからの信号がレーザー間のクロストークなしで回復され、DoV、SNR、または取得時間を損なうことなく時間内に正しく相互登録されています。青、赤、オレンジ、紫、緑は、それぞれレーザー 1、レーザー 2、レーザー 3、レーザー 4 を示すために使用されます。

TD 波長多重化は、波長インターリーブまたはタイムシェアリングを使用して実行されます。ただし、TD 内の波長の数を増やす場合は、次の 3 つのパラメータのうち少なくとも 1 つを犠牲にする必要があります。DoV、パルス列内のパルス数、したがって各波長の SNR、または合計取得時間です。図 2b は、特定の合計取得時間で 4 つの波長を使用した場合に DoV がどのように減少するかを示しています。異なる波長は、同じ繰り返し率 frep を使用して組織を励起しますが、各波長間の時間シフト tsh は tsh = T/N で与えられます（図 2a）。N は波長の数です。その結果、後続のパルス間の時間が短縮され、各波長で利用できる DoV が N 倍に制限されます。あるいは、各波長の繰り返しレート j を frep,j = に下げることで、元の DoV を保持することも可能です。 frep/N および波長あたりのパルス数は Np/N になります（図 2c）。ただし、このアプローチでは SNR が \(\sqrt{N} の係数で減少します。\) 3 番目の代替案では、元の DoV と SNR を維持しながら、取得時間を係数 N だけ延長します (図 2d)。

TDとは対照的に、FWMOTは、各波長の繰り返し率に小さな周波数シフトδfを採用します（図2e、時間）。これにより、δf << frepになります。各波長の繰り返し率は異なるため、実効 DoV もわずかに異なります。ただし、δf << frep であるため、この差は重要ではありません。 FWMOT励起パターンのパワースペクトル（図2e;右）は、各波長の基本繰り返し周波数からの高調波の出現を示しています。最初のレーザーの繰り返し率 frep,1 は基準繰り返し率として選択でき、残りのレーザーの繰り返し率は frep,j = frep,1 + (j − 1) * δf で与えられます。したがって、FWMOT は式 (1) を評価することによって OA 信号を回復します。 (1) 各波長に対応する ω0 = 2πfrep,j を使用します。その結果、FWMOT は、周波数分離を使用して、DoV、SNR、または取得時間を犠牲にすることなく、異なる波長を多重化できます。 FD で処理された信号では、周波数分解能は df = 1/tacq (tacq = Np/frep,1) で定義されます。これは、df 未満の差がある周波数は分解できないことを意味します。したがって、すべての波長から OA 信号を回復するには、超音波トランスデューサー (UST) 検出帯域幅にあるすべてのレーザーからのすべての高調波を周波数分解能 df を超える距離で配置し、最小パルス数 Np,min を課す必要があります。 UST 帯域幅制限 (flow および fhigh)、N および frep,1 に依存します (補足注 2 を参照)。パラメータ N、flow、fhigh、frep,1、および選択したパルス数 Np は、各波長の信号を損失なく回復するために必要な、δfmin と δfmax の間の小さな周波数シフト (δf) の範囲を定義します。 δfmin より大きい δf 値は、UST 帯域幅の下端にあるレーザー j および j + 1 の高調波が良好に分解されることを保証します。一方、δfmax より小さいδf 値は、レーザー 1 および N の高調波が確実に分解されます。 UST 帯域幅の上限では、十分に解決されています。

TD 光音響と比較した多波長励起における FWM 動作の利点を実験的に実証するために、4 つの波長すべてで FWMOT を採用しました。波長1、frep,1 = 200 kHzおよびNp = 200で得られた光音響信号を図2fに示します。これは、tacq = 1 msおよびDoV = 7.5 mmを達成しました。レーザーダイオード（LD）駆動回路からの電磁妨害をαで示します。ペトリ皿上の黒色ワニスから生成される一次 OA 信号は β で示され、時間の遅れて到着する UST ガラスレンズからの反射は γ で示されます。「ノイズレベル」挿入図は、標準偏差 90.6 μV をもたらしたノイズレベルの別の測定値を示しています。 LD1 からの OA 信号の強度は 12 mV と測定され、SNR は 21.2 dB となりました。

図 2g は、DoV が侵害された場合の TD 内の平均化された OA 信号を示しています。各 LD には frep,j = 200 KHz、Np = 200 があり、相互間の時間シフトは DoV = 1.875 mm および tacq = 1 ms になります。図2bのパターンを使用した同時励起から生じるOA信号は緑色の線で示されており、各波長が個別にパルスされたときに得られる個々のOA信号の合計です（図2g）。すべての波長 (α) でレーザートリガー干渉を簡単に検出できました。波長 1 と 2 からの OA 信号 (β) は、それぞれ波長 3 と 4 のレーザー干渉 (α) に非常に近くに位置しており、SNR が大幅に低下します (波長 1 では 5.7 dB)。ただし、波長 3 の OA 信号は波長 1 の干渉によって完全にマスクされます。波長 1、2、および 3 からの OA 信号の反射 (γ) はまだ見えます。したがって、電磁干渉と OA 反射により、複数波長 TD 光音響で達成される DoV と SNR がさらに制限されます。

同様に、tacq = 1 ms で各波長に対して frep,j = 50 kHz、Np = 50、DoV = 7.5 mm を使用する励起パターン (図 2c) に応じて、SNR 制限が課されます (図 2h)。すべての波長で、レーザー干渉 (α)、OA 信号 (β)、および反射 (γ) はすべて可視ですが、SNR が低いことが観察されました。この場合、ノイズ標準偏差（図の挿入図に示されている）は161.6μVであり、平均化するために200パルスのパルストレインで測定された90.6μVよりも高かった（図2f）が、信号強度は12mVのままでした。波長 1 の SNR は 18.8 dB です。最後に、各レーザーの frep,j = 50 kHz、Np = 200、および DoV = 7.5 mm を使用すると、4 つすべてのレーザーの OA 信号を SNR 損失なしで記録できます (N = 90.6 μV および S = 12 mV、波長 1) では 21.2 dB ですが、図 2i に示すように、取得時間は長くなります tacq = 4ms です。

逆に、4つの波長のFWMOT動作では、frep,1 = 200 kHz、δf = 125 Hz、Np = 200を使用し、波長間のクロストークなしで各信号を回復し（図2j）、理論的な予測を実験的に確認します。補足図。図4と5は、FWMOTの動作をさらに紹介し、クロストークなしで各信号を回復する方法の能力を検証するために、レーザーダイオード励起時系列、対応するOA信号時系列、および両方のパワースペクトルを示しています（補足注3を参照）。。 FWMOT は、取得時間 (1 ms) を延長することなく、複数の波長での同時励起に対して高い SNR を提供し、同じ DoV (7.5 mm) と SNR (ここでも N = 90.6 μV および S = 12 mV) を達成できます。波長に対する SNR は 21.2 dB 1)。

平均測定の数を 50 から 200 に増やすと、SNR が 3 dB 増加すると予想されます。ただし、TD 平均化と FWM の両方で SNR の増加は 2.3 dB と測定されました。この不一致は、システム内の系統的な電磁ノイズの存在に起因すると考えられます。これも平均化され、SNR が 0.7 dB 低下します。ただし、この効果は OA システムの一般的な特徴であり、FWM アルゴリズムの欠点ではありません。

また、同じ黒色ワニスファントムと 445 nm の単一波長照明を使用して、従来の FD 光音響で得られた SNR を FWMOT と比較しました (補足図 1 を参照)。 FD 光音響は、200 KHz で 6.8 ns パルスに使用される FWMOT パルスパターンの平均出力と等しくなるように調整された平均出力を持つ 20 MHz 周波数の正弦波を使用しました。 FWMOT は、FD 励起と比較して 20.8 dB 高い SNR を実証しました。

FWM 光音響動作の理論上の利点はファントム測定で実証されましたが、次の重要なステップは、FWM が現実的な実装を提供できるかどうかを検討することでした。このため、理論上の利点が FWMOT を in vivo アプリケーションに適切なものにする動作特性 (SNR、取得速度) につながるかどうかを調査することを目的としました。この調査における特に未知のパラメータは、コストとサイズの理由から複数の固体レーザーで FWMOT を実装するのは非現実的であるため、レーザーダイオードを使用して複数の波長で達成される FWMOT の性能でした。低コスト技術を使用する利点を調べるために、マウスの耳をモデルとして使用して、生体内で血管系とリンパ系を画像化するための複数のレーザーダイオードの性能を調査しました。この画像化ターゲットが選択されたのは、TD 光音響の実装が従来実証されてきた典型的な組織であるためです。

まず、FWMOT が生物標本から高品質の画像を生成できるかどうかを評価しました。 445 nmと465 nmでFWM照明を使用し、スペクトルの違いに基づいてオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンを分解しました（図3a、b）。脱酸素ヘモグロビンは445 nmでより多く吸収し、その逆も同様です。データはグリッド上に収集され、再構成アルゴリズムに入力される前に、まず FWM アルゴリズムを使用してポイントごとに平均化されました (方法を参照)。図 3a、b を重ね合わせると、相対的な血管酸素化の色分けされた合成画像 (図 3c) が明らかになり、赤い色がより高い酸素化レベルに対応します。さらに、FWMOTが波長間のクロストークなしで深さ分解画像（補足図2を参照）を生成できることを確認し、FWMOTがLDに基づいて生体組織から画像を取得できるという最初の証拠を提供しました。

a および b 高い空間分解能を備えた 2 つの青色波長 (それぞれ 445 および 465 nm) でのマウスの耳。 c 合成画像は赤で色分けされており、緑と比較して酸素化レベルが高いことを示しています。 d、e、f、g 4 つの波長すべてにおける 2 番目のマウスの耳。 h マウスの耳の明視野画像。エバンズブルーとICGの皮内注射スポットは画像(f、g、h)で見ることができます。 f、g 注入された色素は、血管とは異なる構造を示すリンパ管に入ります。 i 4 つの波長すべての合成画像。エバンスブルー（シアン）とICG（紫）を同時に摂取すると、酸素化（赤）、脱酸素化（緑）した血管やリンパ管を観察できます。これらの実験は独立して 10 回繰り返され、同様の結果が得られました。すべての画像は、再構成された画像の最大振幅投影です。緑は445 nm、赤は465 nm、シアンは638 nm、紫は808 nm、スケールバーは1 mmです。

次に、FWMOT が TD のような操作特性を損なうことなく、組織内の複数の部分を視覚化できるかどうかを確認することを目的としました。エバンスブルーとインドシアニングリーン（ICG）の皮内注射によって外因性コントラストを導入し、4波長FWMOTを適用して動脈と静脈（図3d、e）とコントラスト強調によって明らかにされたリンパ管（図3f、g）を同時に解決しました。図 3h は、マウスの耳の対応する明視野画像を示しています。 4 つの波長の合成画像 (図 3i) により、血管とリンパ管の視覚化と共局在化が可能になりました。特に、超広帯域トランスデューサーの使用により、注射部位の周囲に形成された大きな吸収領域だけでなく、血管によって表される微細構造を解決することができました。したがって、FWMOT を効果的に使用すると、in vivo で複数の波長を使用した OA イメージングを約 30 分の取得で同時に実行できますが、TD での同じマルチスペクトルの実装には約 2 時間が必要となり、そのような測定は非現実的になります。

図 3 に示されている TD を超える FWM 取得の加速は、複数の波長を使用して急速な変化を同時に検出するための FWMOT の使用を示しています。したがって、生体内酸素ストレス試験中にマウスの耳の酸素化変動を監視するために FWMOT を適用しました。図 4a は、酸素化された血管と脱酸素化された血管を明らかにする 2 つの青色波長からの合成 OA 画像を示しています。約4 Hzのレートで繰り返し信号を取得する（連続FWM動作）ために、2 mmのライン（図4a、青いボックス）を選択しました。 B スキャン (図 4a の文字 (i) で示されている) により、深さの関数として動脈 (赤) と静脈 (緑) が明らかになりました。酸素チャレンジは、呼吸ガスの組成を毎分0.8リットル（lpm）の100% O2（図4b、「O2」）から0.6 lpmの20% O2 + 0.2 lpm CO2（図4b、「O2」）まで変えることによって提供されました。 "空気"）。図 4b は、波長 1 信号 (S1) に対する波長 2 信号 (S2) の比率を時間の経過とともにプロットしています。 S2/S1 比は、時間の経過に伴う血管内の酸素化の相対的な変化を示します。予想通り、実験全体を通して、静脈よりも動脈の方が高い酸素化が観察されました。酸素供給は空気供給中に減少し、100% O2 を供給すると増加しました。動脈の酸素化レベルは、静脈と比較して、空気から酸素供給への変化に応じてより速く増加し、組織への酸素供給の予想される動態を明らかにしました。

a 青色の波長での OA 画像。酸素化された血管 (赤色) と脱酸素化された血管 (緑色) を示します。 a で示される青色の領域で連続 B スキャンを実行し、「i」はそのような断面を示します。「i」内の緑色の矢印と領域は選択した静脈を示し、赤色の矢印と領域は選択した動脈を示します。緑は445 nm、赤は465 nm、スケールバーは1 mmです。 b 酸素ストレス試験中の、波長 2 (S2) の OA 信号強度と波長 1 (S1) の OA 信号強度の比の時間変化。酸素飽和度は比 S2/S1 に比例します。予想どおり、酸素飽和度は静脈よりも動脈の方が速く変化します。 c 同じ実験中の酸素抽出率。 d 2 つの色素、エバンスブルーと ICG の血管内注射中の、同じ動脈と静脈での波長 3 と 4 (それぞれ S3 と S4) でのシグナル強度を a に示します。どちらの場合も、信号強度は最初に動脈で増加し、その後静脈で増加します。これらの実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。

細胞による酸素摂取の指標である酸素抽出速度（図4cのOER）は、OER = (Oca − Ocv) / Ocaとして計算されました。ここで、OcaとOcvは、それぞれ中心動脈と静脈の酸素飽和度です29。。空気供給期間の直後に OER がわずかに低下することが観察され、これは細胞酸素化の応答の遅延を示唆しています。 2 回目と 3 回目の O2 供給期間中に酸素供給量を増加すると、OER の増加が観察され、その後正常レベルに戻りました。これは、酸素が利用可能になるにつれて細胞がより多くの酸素を消費したことを示唆しています。酸素ストレス試験実験により、FWMOT が高い局在化能力を備えた組織動態の研究に使用できる方法であることが確認され、ICG とエバンスブルーの静脈内注射によって確認されました。同じ 2 mm 観察野を使用して、FWMOT は 638 および 808 nm で造影剤の動態を記録しました（図 4d）。両方の色素について同様の注入後のパターンが観察され、ベースライン値に落ち着く前に 2 つの特徴的なピークが明らかになり、血管系における色素の循環動態を示しています。さらに、両方の色素の静脈での薬剤の出現の遅延を解決しました。これにより、観察されたシグナルの増加速度は動脈に比べて低く、このパターンは組織毛細管ネットワーク内の色素の拡散に起因すると考えられます。

我々は、周波数多重化に基づく光音響手法を導入します。これは、TD 実装が最高の光音響性能を提供するという一般的な概念に疑問を投げかけます。 TD 励起、つまりパルス励起の利点を FD 解析と組み合わせることで、FWMOT は多波長励起において TD または FD よりも優れたパフォーマンスを提供します。 TD の波長数 (N) を増やすと、視野深度、SNR、または総取得時間が損なわれます。 FWMOT は、これらのパラメータを犠牲にすることなく複数の波長で同時照明を提供でき、波長ごとに \(\sqrt{N}\) 倍の高い SNR、N 倍の短い取得時間、または N 倍の深度のいずれかを実現します。 TDOA と比較した波長あたりの視野数。さらに、パルス列の使用により、精巧な多周波変調システムを使用した周波数領域での直接操作による FD 信号の生成を回避しながら、周波数領域で必要な離散周波数を提供することで実用的な FWMOT の実装が可能になります。

ここでのもう 1 つの重要な側面は、この方法の理論的な優位性を示すだけでなく、それが実際の実装につながる可能性があることを実証することでもありました。このような性能を可能にする技術は、オーバードライブ連続波レーザーダイオード (CW-LD)26 の使用でした。これは本質的にコスト効率が高く、持ち運び可能でコンパクトであり、高い普及の可能性を秘めたシステムにつながります。 LD は FWMOT に最適であり、固体レーザーの代替として使用できます。フォームファクタが小さく、複数の波長で利用できることに加えて、LD は非常に高いパルス繰り返しレートでパルス化することができ、信号を多重化して平均化する独自の最適な FWMOT 機能に適合し、SNR を向上させます。市場に投入される新しくてより強力な LD は、FWMOT の性能のさらなる向上に貢献し、さまざまなアプリケーションに高い普及の可能性を備えたコンパクトで低コストのシステムを提供するでしょう 9,27。

4 つの波長でのイメージングにより、in vivo で血管構造とリンパ管を区別し、TD で必要な 2 時間から取得時間を約 30 分に短縮しました。また、FWMOT は、主要な動脈および静脈に対して B スキャンを実行する際に、TD と比較して 4 倍高い取得率を達成し、相対的な酸素化変化のモニタリングと酸素抽出率の計算を可能にしました。したがって、FWMOT は動的測定や麻酔を必要とする実験に特に適しており、TD 実装に比べて関連するスループットレートも向上します。

FWMOT で使用される波長の最大数にも制限があり、これは UST 検出帯域幅、取得時間、パルス列の平均数、およびそれぞれの場合に使用される L1 の繰り返しレートに依存します。 frep,1 = 200 kHz、Np = 100、および UST 帯域幅が 22 ～ 78 MHz の場合、最大波長数は FWMOT では 28 ですが、同じ動作パラメータと DoV が 1.5 mm の TD 実装ではわずか 5 です。波長（補足注記 4 を参照）。 FWMOT で使用される波長が増えるほど、TDOA と比較して波長あたりの SNR が増加します。多くの波長を同時に使用することは、OA 分光法の分子検出特異性を向上させるために特に魅力的です。

要約すると、FWMOT は、DoV を損なうことなく複数の波長を同時に使用した高速で高 SNR イメージングを可能にし、動的分子プロセスを研究するための貴重なツールを提供し、将来のマルチスペクトル OA イメージングの実行方法に革命をもたらします。

図 5 は、FWMOT の利点をテストするために開発されたマルチスペクトルラスタースキャン光音響メソスコープ (RSOM) システムを示しています。 Matlab (Matlab 2016b、Mathworks、米国) が PC にインストールされ、システムを制御しました (図 5a)。 PC は、走査ヘッド (図 5c) に配置されたデュアル X-Y ステージを駆動するデュアルチャネルステージドライバー (C-867.260、Physik Instrumente、ドイツ) を制御し、2 つの任意波形発生器 (AWG、33522B、キーサイト、米国）。 AWG はレーザーダイオードドライバーをトリガーし、信号の同期取得のためにデータ取得カード (DAQ、12 ビット、200MS/s、Razor Express 14x2 Compuscope、Dynamic Signals LLC、米国) に同期パルスを提供します。照明システムの光出力は走査ヘッドに向けられ、その一部がフォトダイオード (DET10A2/M、Thorlabs、USA) に入ります。フォトダイオードからの信号はアナログフィルター処理され (BLP-90+、Minicircuits、米国)、パルス間のエネルギー変動と時間ジッターを監視するために記録され、信号の後処理中に両方について補正されます。 UST からの OA 信号は、DAQ によってデジタル化される前に、60dB ゲインアンプ (Miteq AU-1291-R、Miteq、米国) で増幅され、アナログフィルター (BLP-90+ および ZFHP-1R2-S+、Minicircuits、米国) で処理されます。エイリアシングを避けるため。

a システムのさまざまな部分の電気的および光学的接続を示す、開発されたシステムの概略図。 b レーザーダイオード照明システム。各レーザーダイオードは個別のレーザーダイオードドライバーに接続され、2 レンズシステムでマルチモードファイバーに集束されます。 4 つのレーザーダイオードは 4 × 4 ファイバーパワーコンバイナーで結合されており、コンバイナーの各出力は各入力のパワーの約 25% を持ち、すべての波長が結合されます。 c RSOM システムの走査ヘッドは、x-y 走査ステージ (i)、3D プリントされたホルダー (ii)、超音波トランスデューサー (iii)、および配置されたファイバーパワーコンバイナーの 4 本の出力ファイバー (iv) で構成されます。 UST の周りの円形パターン。画像コンポーネントは著作権所有者の許可を得て改変されています。 b の光学機械コンポーネントは Thorlabs Inc. から入手し、c のスキャニングステージ (U-723 XY) は Physik Instrumente GmbH から入手したものです (https://www.physikinstrumente.com/en/products/xy-stages/u-723- piline-xy-stage-1000583/#downloads)。

照明システム (図 5b) は、以前に開発された 4 つの高電流短パルスレーザーダイオードドライバーでオーバードライブされた 4 つの CW レーザーダイオードで構成されています26。つまり、LD のピーク電流は一時的に (ナノ秒間) CW 絶対最大値の 40 倍を超えるまで増加します。これにより、LD はメーカーが指定した絶対最大値よりも最大 27 倍高いピークパワーを提供できるようになります。この作業で使用されるレーザーダイオードは、445 nm で発光する LDM-445-6000 (LaserTack、ドイツ)、465 nm で発光する LDM-465-3500 (LaserTack、ドイツ)、638 nm で発光する HL63283HG (ウシオ電機、日本) です。 nm および 808 nm で発光する K808D02FN (BWT、中国) は、それぞれレーザー 1、レーザー 2、レーザー 3、およびレーザー 4 と呼ばれます。各レーザーダイオードはマルチモードファイバー内で集束されます。各レーザーダイオードを手動 X-Y ステージ (CXY1、当社、米国) に配置するには、コリメートレンズ (C340TMD、当社、米国) を手動 Z ステージ (SM1Z、当社、米国) 上のコリメートレンズ (C340TMD、当社、米国) に配置します。 )、続いて安定に保たれる集束レンズ (C560TME、Thorlabs、米国) と ax-y ステージ (CXY1、Thorlabs、米国) 上のファイバが続きます。コア直径 200um、NA 0.22 のファイバは、4x4 ファイバパワーコンバイナの 4 つの入力のうちの 1 つでした。ファイバコンバイナ (MPC-4-M21-M41-P23、Lasfiberio、中国) の 4 つの出力には、各入力ファイバの入力パワーの約 25% が含まれており、これも 200 µm ファイバコアと 0.22NA のマルチモードファイバです。出力の 1 つはカスタムメイドの 95-5% スプリッター (LTL 500-93310-95-1、LaserComponents Germany GmBH、ドイツ) に接続され、5% ファイバーはフォトダイオードに接続されました。パワーコンバイナの 3 つの出力とスプリッタの 95% ファイバは 1.25 mm フェルール (SFLC230、Thorlabs、米国) で終端され、走査ヘッドに送られました。

走査ヘッド（図5c）は、x-yステージ（U-723 XY、Physik Instrumente、ドイツ）、3Dプリントされたホルダー、中心周波数50 MHzの超音波トランスデューサー（UST、HFM23、Sonaxis、フランス）で構成されています。相対帯域幅 112%、焦点距離 3 mm、NA 0.5、UST の周囲に円形パターンで配置された 4 本の出力ファイバー。 4 本のファイバーの出力は、サンプル上で最大のエネルギー密度を達成するために、UST の焦点で交差するように設計されています。

スキャンと記録は、ステージドライバーをシステムのマスターとして使用し、掃引するような動きで実行されます。 X ステージは等速で直線的に移動します。 X ステージがステップサイズに等しい特定の距離を移動すると、ステージドライバーは AWG に信号を送信してレーザーダイオードをトリガーします。各レーザーダイオードは、各レーザーダイオードの繰り返しレート frep,1 ～ frep,4 と、B スキャンの各ポイント (A スキャン) でのパルス数 Np1 ～ Np4 のパルス列を使用してトリガーされます。ステージが希望の距離を移動すると、B スキャンが完了し、ステージの移動が停止します。 y ステージは次の y 位置に移動し、x ステージは反対方向に次の B スキャンを実行できるようになります。 FWMOT励起には、frep,1 = 200,000 Hz、frep,2 = 200,125 Hz、frep,3 = 200,250 Hz、およびfrep,4 = 200,375 Hzを使用し、レーザー1に対してNp1 = 100およびNp2 = Np3 = Np4 = 101パルスを使用しました。それぞれ 2、3、4 です。これらの値の詳細な導出については、補足注記 2 を参照してください。

マルチスペクトルレーザーダイオード RSOM で使用される 4 つのレーザーダイオードの発光スペクトルを分光計 (USB4000、OceanOptics、英国) で記録しました。ピーク発光波長は 444.3、460.1、636.8、804.9 nm で、分散は 1.6、1.7、1.9 でした。、2.2 nm であり、すべてのケースで R2 信頼レベルは 0.96 より高くなります。

さらに、サンプルのパルスあたりのエネルギーを安定化熱出力計 (PM160T、Thorlabs、米国) で測定し、レーザー 1、2、3、4 でそれぞれパルスあたり 189、137、142、153 nJ と計算されました。パルス幅は、各レーザーの半値全幅 (FWHM) としてそれぞれ 6.7、6.7、10.2、10.2 ns と推定されました。 USB CCD カメラ (daA1920-30 µm、Basler AG、ドイツ) を使用して、サンプル表面の照明スポットが直径約 1 mm の円であると測定されました。表 1 は、上で示した FWMOT 動作の LD パルスと発光特性の概要を示しています。

FD OA と FWMOT 励起を比較するために、アナログレーザードライバー (BFS-VRM 03 HP;ピコラス、ドイツ）。レーザーの出力ファイバーは 4 × 4 ファイバーコンバイナーの入力ファイバーの 1 つにポンピングされるため、サンプルの照明は FD 励起システムと FWMOT 励起システムで同一になります。

信号対雑音比 (SNR) を計算するには、次の式 10 * log10(S / N) を使用しました。ここで、S は信号強度、N はノイズフロアの標準偏差です。

画像取得は、システムの横方向の解像度よりも大幅に低くするために、広い視野 (10 × 10 mm2) で 10 µm のスキャンステップサイズで行われます。各走査位置で検出される時間分解信号は、トランスデューサーの検出角度内の照射された光吸収体から発生する音響球面波の積分に対応します。したがって、システムから直接取得した未処理の画像は大きくぼやけており、高コントラストで高解像度の画像を取得するにはさらなる処理が必要です。これを行うには、逆投影アルゴリズムがフーリエ領域 30,31 に実装され、(音響的に) 回折限界画像が復元されます。結果として得られる画像は、システムのインパルス応答によって補正され 32、さらに表示目的でベッセルネスフィルターで処理されます 33。単一の B スキャンの生データでは 3D 画像の再構成はできません。したがって、2 次元で動作し、トランスデューサーの感度場を B スキャン方向のみに沿った円錐断面として近似する逆投影アルゴリズムの簡略版が開発されました。

システムの空間解像度を計算するために、4 つの波長すべてを使用して解像度ターゲット (シーメンススター) をイメージングしました。結果は補足図3に示されています。これは、4つの波長すべてで解像度ターゲットの再構成されたOA画像と、極座標での合成画像を示しています。空間分解能は、すべての線を適切に分解できる最小半径によって与えられます (補足図 3h)。これは、すべての波長で 38 μm です。

ヘモグロビンは可視および近赤外線の範囲にわたって広い吸収スペクトルを持ち、スペクトルのより低い波長でより高い吸収を示します。脱酸素化ヘモグロビンの吸収は、444 nm での酸化ヘモグロビンの吸収よりも高くなります。 460 nm では、酸素化ヘモグロビンの吸収は脱酸素化ヘモグロビンの吸収よりも高くなります。波長 1 と 2 でのヘモグロビンの総吸収は、波長 3 と 4 での吸収よりもはるかに高くなります。レーザーダイオードのエネルギー出力が低いため、これは、波長 1 と 2 でのヘモグロビンからの OA 信号のみが検出されたと仮定するのに十分です。 . これはマウスの生体内実験で確認されています。さらに、波長 2 の信号強度と波長 1 の信号強度の比 S2/S1 を計算することで、酸素飽和度の相対的な変化 34 を推定できます。比が大きいほど酸素飽和度が高いことを示します。

コントラストを誘発し、波長 3 および 4 で SNR を高めるために、Evan's Blue (Sigma-Aldrich、ドイツ) と ICG (VERDYE、ドイツ) の 2 つの色素を使用しました。エバンスブルーは 640 nm にピーク吸収があり、740 nm に最小吸収があり 35、波長 3 が OA 信号を検出できる唯一の波長であるため、波長 3 のコントラストを高めるのに適切な色素です。血漿中の ICG は、約 810 nm にピーク吸収があり、637 nm に低い吸収を持ちます 36。このため、波長 4 で OA コントラストを誘導し、波長 3 でコントラストを最小限に抑え、他の波長ではコントラストを誘導しないことが適切であることがマウスの耳の実験で確認されました。。

各レーザーダイオードの上記の値 (表 1) と、10 μm の走査ステップサイズに対する 10 mm/s の走査速度を使用して、サンプルの露光量を計算できます。 4 つの波長すべてを同時に照射した場合のサンプルの総露光量は、パルスあたり 19.8 μJ/cm2、平均露光量 3.96 W/cm2 と計算され、MPE 制限である 20 mJ/cm2 および 18 W/cm2 を大幅に下回っています。米国規格協会37． OA における非線形効果は、約 7 mJ/cm2 を超える高エネルギー密度で存在することが実証されています 38。ここでのサンプルの総曝露量は、すべての波長を同時に照射した場合でも、20 μJ/cm2 未満でした。したがって、この研究で蓄積されたエネルギーは、非線形効果の閾値よりもはるかに低かった。

私たちの実験には、生後 5 ～ 6 週間の雌の無胸腺ヌード Foxn1nu マウス 2 匹 (Envigo、ドイツ) を使用しました。すべての測定中、マウスは、キャリアガス流量0.8 lpmの1.6%イソフルラン(cp-Pharma、ドイツ)によって麻酔され、体温は赤外線加熱ランプおよび加熱プレートによって維持された。

最初のマウスは、図 3 に示す実験に使用されました。マウスの耳端に 5 μl ICG (5 mg/ml) と 5 μl エバンスブルー (1%) を皮内投与することにより、リンパ耳管が強調表示されました。色素のリンパ排液を確実にするために、イメージングを開始する前に、ICG を約 30 分、エバンスブルーを約 10 分投与しました。

図 4 に示す実験には 2 番目のマウスを使用しました。酸素ストレス実験では、鼻マスクを介して異なるイソフルランキャリアガスの組み合わせまたは呼吸条件を与えました。マウスは、0.8 lpm の 100% 酸素 (O2) と、0.6 lpm の医療用空気 (20% 酸素) と 0.2 lpm の二酸化炭素 CO2 (空気) の組み合わせを交互に呼吸していました。色素拡散実験では、最初にバックグラウンドデータを取得し、3 分後に 1% エバンスブルー溶液 100 μl を静脈内注射し、さらに 3 分後に 5 mg/ml ICG 溶液 100 μl を静脈内注射しました。両方のマウスは頸椎脱臼により画像化直後に屠殺された。

すべてのマウス実験は、ドイツ、アッパーバイエルン州の動物衛生管理委員会（Az. ROB-55.2-2532.Vet_02-14-88 および Az. ROB-55.2-2532.Vet_02-18-120）に従って実施されました。マウスは、当社の特定病原体フリー (SPF) マウス施設で、周囲温度 22°、相対湿度約 50% の個別換気ケージシステム (Tecniplast、ドイツ) で、規則的な 12 時間の昼夜サイクルで維持されました。ミュンヘン工科大学トランスレーショナルがん研究センター (TranslaTUM)。

著者の一人は、自分の手を画像化するためにこの研究に志願しました。 TUM 倫理委員会との協議の後、正式な倫理承認は必要ありませんでした。参加者からインフォームドコンセントを得てアーカイブしました。参加者は30歳の白人男性。画像取得は、5 × 5 mm2 の視野、10 μm の走査ステップサイズで行われました。再構成されたOA画像を補足図2に示します。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成された、周波数波長多重光音響トモグラフィーアルゴリズムを検証するための生の光音響信号データ、マウスとヒトの生の画像データ、酸素ストレス試験とICGおよびエバンスブルー注入実験の生のB-スキャンデータが保存されています。 Zenodo データベースにアクセッションコード: https://doi.org/10.5281/zenodo.6770729 で登録されています。

著者らは、データ収集には GaGe (Compuscope Driver Version 5.04.34、Dynamic Signals LLC、米国) および Matlab 2016b (Matlab、Mathworks、米国) から市販されているソフトウェアを使用したことを宣言します。データ分析は、Matlab の組み込み関数を使用して実行されました。周波数波長多重光音響トモグラフィーアルゴリズムは特許を取得しており、責任著者の裁量により利用可能です。

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これらの結果につながる研究は、ドイツ、ボンの連邦省 (BMBF) (プロジェクト Sense4Life、13N13855) (VN) から、欧州連合の Horizon 2020 研究とイノベーションに基づく欧州研究評議会 (ERC) からの資金提供を受けています。助成契約 No 694968 (PREMSOT) (VN) に基づくプログラム、および助成契約 No 732720 (ESOTRAC) (VN) および No 862811 (RSENSE) (VN) に基づく欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラムによるものです。原稿執筆にご協力いただいたセルゲイ・スリマ博士とロバート・ウィルソン博士に感謝いたします。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセス資金調達。

ミュンヘン工科大学医学部、トランスレーショナルがん研究中央研究所 (TranslaTUM) 生物イメージング学部長 (ドイツ、ミュンヘン)

アントニオス・スティロギアンニス, ルートヴィヒ・プラーデ, サラ・グラスル, クタイバ・ムスタファ, クリスチャン・ザキアン & ヴァシリス・ンツィアクリストス

生物学および医療画像研究所、ヘルムホルツツェントルムミュンヘン、ノイヘルベルク、ドイツ

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AS と LP は、多波長 RSOM システムを開発しました。 LP は、周波数波長多重信号処理技術を開発しました。 AS はさらに、周波数波長多重アルゴリズムに取り組み、オーバードライブ CW-LD 励起源を開発し、イメージング実験を実行してデータを処理しました。 SG は AS のマウス実験の実施を支援しました。 QM は光音響画像を再構成しました。 CZ と VN は、この研究の実施にあたり広範な議論と指導を支援しました。

ヴァシリス・ンツィアクリストスへの通信。

VN は、sThesis GmbH、iThera Medical GmbH、Spear UG、および i3 Inc. の創設者および株式所有者です。残りの著者には競合する利害関係はありません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Frans Harren と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Stylogiannis、A.、Prade、L.、Glasl、S. 他。周波数波長多重光音響トモグラフィー。 Nat Commun 13、4448 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32175-6

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受信日: 2021 年 7 月 6 日

受理日: 2022 年 7 月 20 日

公開日: 2022 年 8 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32175-6

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