マウス体性感覚野の顆粒化領域とバレル領域における明確な侵害受容処理

Nature Communications volume 13、記事番号: 3622 (2022) この記事を引用

2851 アクセス

1 引用

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

痛みの体性識別側面である侵害受容は、接触と同様、一次体性感覚皮質 (S1) で表されますが、S1 内の 2 つのモダリティの分離と相互作用は依然として不明です。 ここでは、マウス S1 の顆粒バレル領域 (BF) と隣接する顆粒異常領域 (Dys) における空間的に異なる触覚および侵害受容処理を示します。 サブ領域にわたるマルチユニット活動の同時記録により、Dys ニューロンは有害な入力に対してより応答性が高いのに対し、BF ニューロンは触覚入力を好むことが明らかになりました。 単一ニューロンレベルでは、侵害受容情報はDys層2/3の触覚情報とは別に表現されます。 対照的に、両方のモダリティは、程度は異なりますが、各領域の個々のレイヤー 5 ニューロンに収束しているように見えます。 全体として、これらの発見は、Dys と BF の間の侵害情報と触覚情報の層固有の処理を示しています。 さらに、BF 活性ではなく Dys 活性が疼痛様行動に決定的に関与していることを実証しました。 これらの発見は、S1 における疼痛処理の役割についての新たな洞察を提供します。

一次体性感覚野（S1）は、触覚情報処理において中心的な役割を果たしています1。 S1 の触覚表現は、体性感覚的に整然と配置されています2。 一方、S1 は、痛みの位置、強度、質など、痛みの処理の体性識別面を担当します 3、4、5、6、7、8、9、10。 S1 は視床皮質の侵害受容情報 11 を受信し、それを痛みの感情面を担当する前帯状皮質などの他の痛みに関連する皮質領域に中継します 12,13。 S1 はまた、急性および慢性の両方の疼痛状態下で、皮質三叉神経 14 および皮質脊髄 15 経路を介した有害な入力を調節します。 したがって、S1 は、疼痛処理のネットワークハブであり、疼痛を制御するための介入のターゲットとみなすことができます。 しかし、S1が侵害情報と体性触覚情報をどのように区別して処理するのかは依然として不明である。

マウス S1 は、細胞構造に基づいて 2 つのサブ領域に分けられます。バレル フィールド (BF) として知られる顆粒領域は、層 (L4) ニューロンの固有のクラスターによって識別され、隣接する顆粒異常領域 (Dys) は明確に定義されていません。 L46、16。 2 つのサブ領域は機能的に異なると考えられています。 たとえば、BF はひげからの触覚入力を処理する中枢であり 17、18、19、Dys は深部筋肉の刺激または関節の回転から固有受容入力を受け取ります 20、21。 侵害受容では、より深い層の BF ニューロンが有害な入力を受け取ります 11、22、23。 同様に、より深い層にある Dys ニューロンは、有害な挟み込みや痒み入力に反応します 24,25。 ただし、2 つのサブ領域間の直接の比較が不足しているため、各サブ領域が触覚情報の有無にかかわらず侵害情報をどのように処理するかは不明のままです。

ここで、両方のサブ領域を同時に記録することにより、侵害情報と触覚情報がそれぞれDysとBFで別々に表現される傾向があることを発見しました。 Dys はまた、末梢神経損傷によって引き起こされる神経障害性疼痛条件下でも主に活性化されました。 侵害受容の空間的に異なる表現を反映して、BFではなくDysのニューロン活動の光遺伝学的阻害は、有害な入力によって誘発される痛みのような行動を減少させた。 したがって、我々は、有害な入力から適切な逃避行動を生成するDysの疼痛処理における明確な機能的役割を明らかにした。

まず、ウィスカーパッドに有害な熱刺激（noxH; 45〜50℃）を加えたときのDysとBFの応答特性を比較しました（図1a）。 細胞構造上、BF内の隔壁は顆粒異常領域に属しますが、BFを囲む顆粒異常領域をDysと名付けました。 L2/3、L4、L5a、L5b の Dys ニューロンと BF ニューロンからマルチユニット活動 (MUA) を同時に記録しました。 Dys の MUA は、ペルチェ デバイスの温度が有害な範囲 (45 ～ 50 °C) に達すると、記録されたすべての層で増加しましたが、BF では応答が層間で異なりました。NOxH に対する MUA は、L2/3 または L4 では増加しませんでしたが、 L5aではわずかに増加しました（図1b）。 noxH の好みを評価するために、信号対雑音比 (S/N; 方法を参照) を計算しました。 noxH に対する応答（図 1b で S と表示、ベージュ色の陰影領域）をシグナルとして使用し、有害な熱範囲（33 ～ 45 °C、図 1b で N と表示、灰色の陰影領域）への応答を使用しました。ノイズとして使われていました。 同時に記録されたニューロンペアの比較により、DysニューロンはBFニューロンよりもnoxHに対してより反応性が高いことが示されました（図1c、L2 / 3についてはP = 0.0056、L4については0.0056、L5aについては0.049、n = 8動物）。 Dys と BF の同じ層の S/N 値を比較すると、Dys の S/N は L2/3 の BF よりも大幅に高かった（P = 0.89 × 10−4、多重比較テスト、図 1d）。 BF内では、S/NはL2/3よりもL5aの方が有意に高かった（P = 0.03、図1d）。 BF における noxH 応答の層間のこの違いは、以前の研究 22、23、26 と一致しています。 この傾向は、定常状態温度 (約 30 °C) でのペルチェ デバイスの応答をノイズ信号として使用して S/N を計算した場合にも観察されました。 総合すると、Dys の MUA は、BF よりも noxH に対して高い感受性を示しました（図 1e）。 また、ウィスカーパッドへのカプサイシン注入後の有害な入力に反応するS1内の領域における、ニューロン活動のマーカーであるc-Fosの発現を調べました（補足図1a）。 DysとBFを区別するために、それぞれニューロンと視床皮質末端のマーカーであるNeuNとVGluT2で共免疫染色しました（補足図1b）。 c-Fos 陽性ニューロンの数は、Dys の L4 (P = 0.0027) と BF の L5a (P = 0.0249、補足図 1c) で大幅に増加しました。 したがって、有害な入力がDysの表層とBFのL5aを活性化することを確認しました。

a 左側のウィスカーパッドに有害な熱刺激 (noxH) を加えながら、Dys と BF を同時に記録するためのセットアップ。 電極の軌跡を示す脳切片 (DiI、赤)。 VGluT2 (緑色) 染色は、Dys と BF の境界を示します。 スケールバー、500μm。 b Dys および BF の L2/3、4、および 5a の noxH への代表的な MUA 記録の PSTH。 斜線部分はS/N比を算出する領域を示す。 c noxH 刺激に応答して同時に記録されたマルチユニット活動の S/N の散布図。 両側ウィルコクソン符号付き順位検定によると、L2/3 (n = 25) では P = 0.000023、L4 (n = 17) では 0.0056、L5a (n = 16) では 0.049、L5b (n = 6) では 0.69 でした。 対角線は単一性を示します。 d noxHに対するS/N応答の統計的比較。 *P = 0.030、**P = 0.89 × 10−4 クラスカル・ウォリス検定とそれに続くシダック検定による。 n = 8 匹の動物。 箱ひげ図 (25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルの中央値)。 ひげを越えたデータ ポイントは点で示されます。 e S1 の侵害受容領域を示す概要図。

次に、ひげのたわみに対する応答の S/N を比較することにより、触覚刺激に対する応答の好みを評価しました (方法を参照)。 BFのニューロンは各ひげの偏向の開始に正確に反応しましたが、Dysのニューロンは反応しませんでした（図2a、b）。 ひげのたわみに対するS/Nは、各層のDysよりもBFの方が高く（図2c、d）、触覚刺激に対するBF応答がDys応答よりも強いことを示しています（図2e）。 ウィスカーパッドは熱によって直接刺激されたため、ペイントブラシをウィスカーパッドに置き（これは熱刺激と同等の位置です）、触覚刺激に対する反応をテストし、BFがDysよりも触覚刺激を好むことを確認しました（補足図1）。 2)。

a ひげの触覚刺激に対する Dys と BF の反応を記録するためのセットアップ。 斜線部分は、触覚入力の S/N を計算するために信号 (S) とノイズ (N) として使用される時間を示します。 b 同時に記録されたDysとBFのL2/3、4、および5aの触覚刺激に対するMUAのPSTHの例（図1eも参照）。 c 触覚刺激に対して同時に記録された MUA の S/N の散布図。 両側ウィルコクソン符号付き順位検定による P = 0.0038 (L2/3) (n = 25)、L4 (n = 17)、0.028 (n = 17)、L5a (n = 16)、および L5b (n = 6) の 0.063 。 対角線は単一性を示します。 d 触覚刺激に対する S/N は BF L2/3 の方が高かった。 **Kruskal-Wallis 検定とそれに続く Sidak の検定による P = 5.4 × 10−4。 n = 8 匹の動物。 箱ひげ図 (25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルの中央値)。 ひげを越えたデータ ポイントは点で示されます。 e S1の触感嗜好領域を示す概要図。

MUA解析の結果、DysとBFの間には侵害情報処理に空間的な偏りがあることが示されました（図1）。 したがって、我々は 2 つのサブ領域における単一ニューロンのモダリティ特異性を調べました。 L2/3 および 5 は、運動皮質および前帯状皮質と接続する皮質出力層であり、痛みのような行動に関与しています 13,27。 2つのサブ領域から同時に記録された、L2/3の十分に分離されたニューロンの刺激周囲時間ヒストグラム（PSTH）を図3aに示します。 記録されたニューロンは、熱刺激に対するピーク反応の時間によって分類されました。 Dys L2/3 では、熱刺激に対するピーク応答の急峻度が有害熱範囲内で増加し、Dys ニューロンの大部分が有害熱に反応したことが示されました。 対照的に、BF L2/3 では少数のニューロンのみが応答しました (図 3a、左列の白いボックス)。 一方、多くのBF L2/3ニューロンは触覚刺激によく反応しました。 注目すべきことに、Dys L2/3の有害な熱反応ニューロンは触覚刺激に反応しませんでした（図3a、右列の白いボックス）。

a 有害な熱 (noxH) (左) および触覚 (右) 刺激に対する L2/3、L5a、および L5b の同じニューロンの応答の PSTH。 熱刺激は 50 ms/bin、触覚刺激は 5 ms/bin。 各行は noxH のピーク応答時間によって並べ替えられ、発火率は各行のピーク応答 (ボックス領域) によって正規化されました。 b noxHおよび触覚刺激に対するS/Nに従って並べ替えられたパネルaおよびbのヒストグラムの平均値：侵害受容細胞、触覚刺激、統合細胞（侵害受容細胞と触覚細胞）、および非反応性細胞（なし）（補足図3を参照） 。 *P < 0.05 対 非反応性 (両側クラスカル・ウォリス検定とそれに続くテューキー検定)。 網掛けは SEM を示します。 c 各エリアの L2/3、L5a、および L5b のセルタイプの分布と概要図。 d 神経反応がピークスパイク率の 80% に達した温度から決定された熱閾値の分布。 L2/3 および L5b では、Dys ニューロンは有害な熱に調整されていたのに対し、BF ニューロンはさまざまな温度に反応しました (*P = 0.013、**P = 0.005、分散に関する 2 サンプルのアンサリ・ブラッドリー検定)。 e 応答が抑制されたニューロンのパーセンテージ (S/N < 1)。 ***P = 5.4 × 10−8、BF と Dys 間の 2 × 2 χ2 検定。

熱刺激に対するピーク応答の急峻さは、より深い層の両方の領域の有害な熱範囲内で増加しました（図3a、左列のL5aおよびL5bの白いボックス）。 この傾向は、侵害受容ニューロンがより深い層で増加していることを示しています。 Dys L5a を除いて、L5 の侵害受容ニューロンは触覚刺激にも反応する傾向がありました (図 3a、右列の白いボックス)。 したがって、L2/3のDysニューロンは、触覚情報とは別に侵害情報を処理しますが、L5のニューロンは、触覚入力と侵害入力の両方に反応する傾向があります。

これらの観察を定量化するために、noxHおよび触覚刺激に対するS/Nに従って、ニューロンを侵害受容型、触覚型、統合型、および非反応型に分類しました（図3bおよび補足図3）。 S/N の分布は、記録されたすべてのニューロンの S/N 中央値に従ってクラスター化されました（侵害受容の場合は 1.46、触覚の場合は 1.81、補足図 3b、d、f、g）。 さらに、これらの値に従って分類されたニューロンの正規化PSTHは、各ニューロングループの特性を表しました（図3b）：侵害受容型ニューロンは有害な熱に応答しますが、触覚刺激には応答しません、触覚型ニューロンは触覚入力には応答しますが、触覚入力には応答しません有害な熱と統合型ニューロンは両方の刺激に反応しました。 したがって、分類のカットオフ値として中央値 S/N を使用しました。 この分類に従って、各サブ領域内の各タイプのニューロンの割合が計算されました（図3c）。 集団PSTH（図3a）と一致して、L2 / 3の大部分のニューロンでは、侵害情報はDysで別々に処理され、触覚情報はBFで処理されました。 さらに、Dys L2/3の多くの触覚型ニューロンは、BF L2/3のものよりも触覚刺激に対する開始潜時が比較的長くあり（補足図4）、これらのニューロンがBFから触覚情報を受け取っていることが示唆されています。 対照的に、両方の領域のL2 / 3における統合型ニューロンの発症潜時はより長かった（補足図4）。

より深い層では、侵害受容情報と触覚情報が両方のサブ領域のニューロンの大部分に統合されていました（図3c、下）。

より深い層の Dys ニューロンと BF ニューロンが主に有害な熱刺激に反応したことを考慮して、有害な機械的刺激に対するニューロンの反応も調べました 22。 フォン・フライ（10 g）の有害な機械的刺激に対する誘発反応を調べました（補足図5）。 L5b の Dys と BF の MUA は、10 g の加重 von Frey フィラメントを適用すると増加しました（補足図 5a）。 BF L5bおよびDys L5bのMUAは、von Freyフィラメントが曲がったときに最大応答に達しました（つまり、ウィスカーパッドが10 gで刺激された、補足図5b）。 有害な刺激に対する最大応答の急峻度は、Dys L5b および BF L5b で増加しました（補足図 5b）。これは、より深い層内の多くのニューロンが有害な機械的刺激にも反応することを示しています。

PSTH集団（図3a）では、熱刺激に対する反応の開始はニューロン間で異なり、特にBF L2 / 3およびL5bで、ニューロンがさまざまな温度に反応したことを示しています。 したがって、熱刺激に対するニューロンの熱閾値（80％最大応答）から温度感度を調べました（図3d）。 両方の領域の L2/3 ニューロンは、有害な温度 (-44 °C) から反応を開始しました。 Dys ニューロンの熱閾値の分布は、BF ニューロンではなく、L2/3 (P = 0.013) および L5b (P = 0.0051) の有害な熱範囲の周囲に著しく蓄積されました (図 3d)。 これらのデータは、Dys ニューロンが有害な熱温度によく調整されているのに対し、BF L2/3 および L5b のニューロンは皮膚温度をコード化していることを示唆しています 28,29。

平均PSTH（図3b）は、触覚ニューロンおよび非反応性ニューロンのニューロン活動がnoxHによって抑制されたことを示しています。 これらのニューロンの S/N は 1 未満であったため、各領域で noxH によって抑制されたニューロンの割合を推定しました。 BF L2/3では、ニューロンの60％がnoxHによって抑制されました（図3e）。 このパーセンテージは、Dys のパーセンテージ (22%、P = 5.4 × 10−8) よりも大幅に大きくなっています。 これらのデータは、痛みの状態下での触覚識別能力の欠陥の根底にある神経機構を説明する可能性があります 30,31。

要約すると、データは、侵害受容情報がDysとBFの表層で触覚情報とは別に処理され、より深い層では統合される傾向があることを示しています。 熱閾値の違いは、Dys が有害な熱入力を処理し、BF が温度コーディングを担当していることを示しています。

次に、Dys 活動が病態生理学的条件下での疼痛処理に関与しているかどうかを調べました。 S1 は慢性疼痛下で活性化され 12、13、32、33、末梢神経線維損傷は体性局所の再組織化と機械的過敏症を引き起こすことが提案されています 34、35、36、37、38、39。 そこで、眼窩下神経（ION）の結紮による三叉神経痛モデルを適用し、機械的異痛症の発症中にS1の空間皮質活動がどのように変化するかを調査しました。 この目的に向けて、吸収性外科用糸を使用しました (方法を参照)。これにより、同じ動物の機械的異痛症状態と回復状態を観察することができました。

我々はまず、ION 結紮による機械的異痛症の発症の時間経過を調べました。これは、von Frey フィラメント テストの逃避閾値によって評価されました。 マウスは、外科用糸の引張強度が約50％の場合に異痛症を示し、引張強度が最大強度の0％に低下すると回復しました（補足図6）。

次に、機械的異痛症状態（POD7）および回復状態（POD21、図4a、b）の前および最中に、同じ動物から継続的にひげ刺激によって誘発される固有の信号を記録しました。 ひげ刺激によって誘発された BF における明らかな固有シグナルが、ライゲーション前に観察されました (図 4b、左)。 アロディニア状態（POD7）では、BFのシグナルは消失しましたが、隣接領域では増強されました（図4b、中央）。ただし、シグナルコントラストは比較的低かった（図4b）。 回復状態 (POD21) では、BF の信号が再び現れました (図 4b、右)。 一連の記録の後、POD7でシグナルが検出されたBFの隣接領域が、その後の組織学的分析でDysであることを確認しました（図4cおよび補足図7）。

a ピエゾデバイスによるひげ刺激中の固有信号イメージングを示す概略図。 赤色 LED は固有信号イメージングに使用され、緑色 LED は脳表面の血管パターンを取得するために使用されました。 b 上、吸収性外科用糸による眼窩下神経 (ION) 結紮の時間経過の概略図。 中央、動物の固有の信号イメージの典型的な例。 下、位置合わせに使用された信号領域 (黄色) と血管パターンの重ね合わせ画像。 c S1 L4 の接線方向の切片のシトクロム c オキシダーゼ染色。 FP、前足。 HP、後足。 d 平均 Z スコア画像 (結紮グループ、n = 5、偽グループ、n = 3)。 点線の領域は、結紮前のひげ刺激によって活性化された BF を示します。 R、吻側。 L、横方向。 POD、術後 1 日。 スケールバー、1 mm。

結紮および回復中のDysニューロン活動を確認するために、個々の動物のPOD7およびPOD21でDysおよびBFの刺激誘発性MUAを記録しました（補足図8a、b）。 BFとDysの間の活性のバランスが変化しました（補足図8a、b）。 Dys 活性は、POD7 での結紮中に一部の動物で BF よりも高かった（補足図 8a）。 さらに、BF活性はPOD21で回復しました（補足図8b）。 したがって、ニューロン活動の空間的合計および局所的なニューロン活動の電気生理学的記録から得られる内因性信号イメージングは​​、Dys 活動の変化を過小評価する可能性があります。 したがって、マウスが豊富な環境を探索した後のマウスのc-Fos陽性ニューロンもカウントしました40,41（方法、補足図9aを参照）。 内因性シグナルイメージングの結果と一致して、c-Fos 陽性ニューロンの数は、POD7 で Dys では大幅に増加しましたが、BF では減少しました。 ただし、POD21では、BFのc-Fos陽性ニューロンの数が回復しました（補足図9b、c）。 このように、末梢神経損傷の程度に応じて活性化領域が動的に変化し、疼痛様状態ではDysの神経活動が亢進した。

最後に、Dys が有害な刺激から逃れるなどの痛みに似た行動に関与しているかどうかを調べました。 このために、左側のひげパッドに照射された無害または有害な赤外線（IR）レーザーに反応して、球形のトレッドミル42上を自由に移動する頭部を拘束された動物の行動を監視しました（図5a）。 IR レーザーを 500 ミリ秒および 1500 ミリ秒照射すると、皮膚温度がそれぞれ 39 °C および 52 °C に上昇します 43。したがって、これをそれぞれ無害な熱 (innH) および noxH と呼びます。 noxHに応答して、IRレーザー刺激の開始後5秒まで移動速度が増加し、マウスが有害な入力から逃げようとすると、走行方向が有害な入力とは反対側に変わりました（図5b〜dおよび図5d）。補足図 10a、方向)。 動物はまた、痛みの表現であると考えられる、まばたきや締めつけを示しました（補足図10a）。 したがって、このシステムは、noxH に応じた痛みのような行動を定量化するのに適していました。

a 球形のトレッドミル上で頭部を拘束され、自由に動く動物の左のひげパッドに 808 nm の赤外線 (IR) レーザーを照射することによって誘発される逃避行動をモニタリングするための概略図。 動作の方向と速度は背面のカメラで監視され、顔の表情と前肢の動きは側面のカメラで監視されました。 b 500 ms および 1500 ms の IR 刺激に応答した脱出速度の例。それぞれ、0.09 (無害な熱、innH) および 0.27 J/mm2 (noxH) に相当します。 c IR刺激あり（innH、オレンジ; noxH、赤）およびなし（黒）の平均速度プロファイル（n = 6マウス）。 *P < 0.05、**P < 0.01。 d IR 刺激によって誘発される最大速度 (n = 6 マウス、ns、有意ではない; **P = 3.1 × 10−6 (刺激なし vs noxH)、0.0055 (innH vs nox H); 一元配置分散分析とそれに続くTukey-Kramer テスト。)。 e noxH刺激中にチャネルロドプシン-2（ChR2）の473 nm光活性化を介して6つのS1位置（430μm離れた）をサイレンシングするスキーム。 スケールバー、1 mm。 +、ブレグマ; R、吻側。 L、横方向。 D、背側。 f 平均速度プロファイルは、P3 (青) または P4 (シアン) での光遺伝学的抑制により、noxH への逃避速度が大幅に低下したことを示しています (n = 6 マウス)。 *P < 0.05。 g 最大速度の平均 Z スコア (n = 6 マウス)。 **P = 2.3 × 10−5 (noxH 対 P3)、2.0 × 10−4 (noxH 対 P4); 一元配置分散分析とそれに続く Tukey-Kramer 検定。 陰影とエラーバーはマウスの SEM を示します。

このシステムを使用して、Dys 活性の調節が疼痛様行動に与える影響を調べました。 Dysを含むさまざまな皮質領域の光遺伝学的抑制中にnoxHによって誘発される痛みのような行動を監視しました（図5e）。 この実験では、脳幹と小脳を介した反射動作が関与する、まばたきや目の締め付けは評価しませんでした47。 我々は、パルブアルブミン（PV）発現介在ニューロン（PV-Cre×Ai32）でチャネルロドプシン-2（ChR2）-EYFPを発現するトランスジェニック系統を使用し、PV介在ニューロンを光活性化して皮質錐体ニューロンを局所的に阻害しました48、49、50（図5e）。 。 Dys は BF に隣接する狭い領域 (約 0.4 mm) であるため (接線方向の断面、図 4c)、BF または足領域を除外しながら Dys を刺激することは困難です。 そこで、6 点のレーザー刺激位置を変更し、挙動を比較しました 48,50。 位置 3 (P3) および P4 での光阻害は、主に Dys と足領域または BF の一部をカバーしていましたが、noxH に応答して脱出速度を大幅に減少させました (P3 および P4 で 1.5 ～ 2 秒、P < 0.05; および 2 ～ 2.5 秒) P4、n = 6、図5f)。 対照的に、BFまたは足領域などの他のS1領域の光阻害は効果がありませんでした（P > 0.05、補足図11）。 同様の傾向が、最大速度（P3およびP4で P < 0.01、他の位置では有意ではない、図5g）​​および脱出方向と距離の変化（補足図10b）でも観察されました。 要約すると、P3およびP4での光阻害が、有害な入力の反対方向に走るマウスの逃避行動を抑制することを確認しました。 ChR2を発現しない対照マウスでは、青色レーザー刺激は脱出速度に影響を与えませんでした（補足図12）。 これらの結果は、Dys ニューロンの光遺伝学的局所抑制により、noxH によって引き起こされる疼痛様行動が減少したことを示しています。

この観察を裏付けるために、視床皮質線維を光活性化してDysを活性化しました。 内側後核（POm）ニューロンは視床からS111に侵害受容情報をもたらすと考えられているため、逆行性および順行性トレーサーによってPOmニューロンからDysへの接続を確認し（補足図13）16、ウイルス誘発性のマウスを利用しました。 POmニューロンにおけるChR2（AAV9-hSyn-ChR2（H134R）-EYFP）の発現（補足図14a）16。 これらのマウスを使用して、innHに応答したDysの光活性化により、noxHに応答したものと似たトレッドミル速度プロファイルが得られることが観察されました（補足図14b）。 同様に、Dys光活性化と組み合わせたinnHの最大速度は、noxHに応答した場合の最大速度とほぼ同じでした（P = 0.99、補足図14c）。 同様の傾向が脱出方向と距離についても観察されました（補足図14d、e）。 これらの結果は、ChR2 を介した Dys の光活性化が疼痛様行動を増強したことを示しています。 POmにChR2を欠く対照マウスでは、青色レーザー刺激は効果がありませんでした（補足図14f-j）。 要約すると、光遺伝学的研究は、Dys 阻害が疼痛様行動を軽減する一方、Dys 活性化が innH に応答して疼痛様行動を誘発することを実証し、疼痛様行動の生成における Dys の役割を明らかにしました。

この研究により、Dys は有害な入力に対して高い感受性を示すのに対し、BF は触覚入力を好むことが明らかになりました。 特に、Dys L2/3 では侵害情報は触覚情報とは別に処理されます。 Dys は神経因性疼痛にも反応します。 侵害受容の空間的に異なる表現を反映して、Dys 活性の光遺伝学的抑制は有害な熱誘発性の痛みのような行動を減少させましたが、BF における同じ操作は行動への影響を示さなかったのです。 これらの発見は、Dys が侵害受容と痛み様行動の生成に関与していることを示しています。

これまでの研究では、侵害反応性皮質ニューロンがBF11、22、23およびDys24の深層に位置していることが報告されているが、2つのサブ領域間の機能の違いは不明のままである。 ここでは、Dys と BF が、特に L2/3 において、侵害受容と触覚の処理において分離した役割を担っていることを実証します。 我々の神経生理学的データはさらに、noxH 入力が BF L2/3 の神経活動を抑制することを示しています。 この抑制は、痛みの際の触覚の鋭さを混乱させる神経基盤である可能性があります 30,31。

L2/3 とは対照的に、L5b では侵害情報処理と触覚情報処理の分離があまり明確ではなく、両方の領域で統合ニューロンの割合が高くなりました。 しかし、L5 BF ニューロンにおける触覚刺激に対する優先性は維持されました。 BFニューロンは、Dysニューロンよりも触覚入力に対して高い選好性を示しました（図2c）。 L5 ニューロンは皮質遠性経路を介して侵害受容入力を調節すると示唆されているため 14,15、BF L5 ニューロンは通常の条件下で接触誘発性疼痛緩和に関係している可能性があり 51、Dys L5 ニューロンは機械的異痛症に寄与している可能性があります (図 4)。

本研究における注目すべき発見は、BFではなくDysが逃避行動の生成に関与していることである（図5）。 適切な逃避行動のためには、動物は有害な入力から離れる方向に走る必要があります（図5dおよび補足図10a）。 局所PV介在ニューロンの光遺伝学的活性化によるDysの不活化は、逃避速度を低下させ、有害な入力から逃れるための方向選択性を破壊しました（図5gおよび補足図10b）。 いくつかの解剖学的証拠は、Dys が運動機能と痛みの処理に密接に関連していることを示唆しています。 例えば、Dys は POm16、20、21 を介して固有受容入力を受け取り、一次運動野に投射します 27。 Dys はまた、感覚痛と感情痛を統合し、痛みのような行動を調節する前帯状皮質 27 にも投射します 12,13。 さらに、Dys は、侵害受容情報の処理に関与する二次体性感覚皮質 27 とニューロン接続を持っています 52,53。 したがって、Dys 媒介ニューロン ネットワークは、固有受容と侵害受容の処理を統合することにより、適切な逃避行動を促進すると考えられます。

POmからDysに突き出ている視床皮質線維の光活性化は逃避行動を誘発し（補足図14）、Dysの光遺伝学的阻害からの所見を確認しました（図5）。 POmのニューロンはDys L4およびBF L516、54、55に投影するため（補足図13b）、BFの寄与を完全に排除することはできない可能性があります。 BF の活性化は、L514 からの皮質三叉神経軸索のフィードフォワード阻害を介して疼痛様行動を軽減します。 さらに、Dys からの下降突起は、BF56 などの S1 皮膚領域からの突起とは異なる領域で終了します。 これらの報告を考慮すると、現在の研究では、疼痛行動を誘発する POm-S1 線維の光活性化は、POm-Dys 線維の活性化の結果であると考えられます。 これらの発見は、Dys と BF が逃避と痛み様の行動に対して異なる効果を生み出すことを示唆しています。

S1 活動を制御すると、疼痛閾値が調節されることが示唆されています 14,33。 Dys 活性の操作が疼痛様行動を制御することを考えると (図 5)、S1 の侵害反応領域の選択的阻害は、S1 の他の機能に影響を与えることなく、臨床疼痛管理における治療標的となる可能性があります。 S1 の大脳皮質病変は永続的な痛みの軽減を引き起こします (Whitsel et al 57 で総説)。 非ヒト霊長類領域 3a は細胞構造 57 に基づいた顆粒異常領域のニューロンであり、有害 8,57,58 および固有受容入力 59 に応答します。 これらの観察と系統関係 60 は、霊長類領域 3a がげっ歯類の Dys の進化的相同体であることを示唆しています。 さらに、人間の領域 3a は痛みの知覚において中心的な役割を果たしている可能性があります 61。 したがって、人間の領域３ａは、痛みを軽減するための理想的な介入対象の１つである可能性がある。 しかし、ヒトでは領域 3a は中心溝の眼底に埋もれています 62。 したがって、領域 3a への選択的介入は困難であり、将来的に慢性疼痛を効果的に治療するには解決する必要があります 57,58。 それにもかかわらず、我々の結果は、S1 の独特の侵害受容領域が疼痛緩和の潜在的な治療標的であることを強く示唆しています。

すべての外科的処置および術後の管理は、東京女子医科大学の動物管理および使用委員会のガイドラインに従って行われた。 すべての動物実験は番号 AE19-109 で承認されました。 C57BL/6 N (三共ラボサービス株式会社、東京、日本)、PV-Cre (JAX 株 #008069)、および Ai32 (Rosa-CAG-LSL-ChR2[H134R]-EYFP-WPRE; JAX 株 #012569)この研究ではマウス系統を使用しました。 PV-Cre マウスを Ai32 マウスと交配し、得られたマウス系統を PV-ChR2 と名付けました。 ８週齢以上の雄マウスを使用した。 動物は、23℃±1℃、湿度50±15%に維持されたケージ内で12時間の明暗サイクルで集団飼育され、すべての行動試験は暗期に実施されました。 この研究では、使用されたマウスの数とその苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。 外科的処置のために、各動物はケタミン（100 mg/kg 体重）およびキシラジン（16 mg/kg 体重）の腹腔内注射によって麻酔され、麻酔を維持するためにイソフルランが補充された。 局所麻酔のために、リドカインを切開部位の皮下および創傷縁に適用した。 固有信号の光学イメージング、電気生理学的記録、および球状トレッドミルでの行動試験のために、特注のヘッドプレートを歯科用アクリル透明樹脂（スーパーボンド、サンメディカル、滋賀県）で頭蓋骨に取り付けました。 頭部プレートを移植した動物をホームケージに戻し、少なくとも４日間手術から回復させた。

Dys および BF からの電気生理学的記録のために、各マウスは塩酸クロルプロチキセン (2 mg/kg 体重) の腹腔内注射を追加したイソフルラン (0.4 ～ 0.8%) で麻酔されました 63。 侵害受容反応は麻酔レベルに依存するため 64、麻酔レベルを制御するために呼吸数 (70 ～ 120 サイクル/秒) をモニタリングしました。

まず、ひげ刺激による固有信号イメージングにより、Dys と BF の境界を同定しました (「固有信号光イメージング」を参照)。 次に、DiI (V22885、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で染色した 32 チャンネル 4 シャンク電極 (A4x8 または Buzsaki32; NeuroNexus、米国ミシガン州アナーバー) を Dys と BF の両方に挿入しました。 E列ひげの受容野の各領域からの神経活動を同時に記録しました。 E列のひげとE列65の周りのひげパッドを覆う受容野を持つニューロンを記録するために、少なくとも2つのシャンクをE列バレルに配置し、E列バレルに隣接するDysを配置しました（図1a）。

生の電気信号は 40 kHz で増幅およびデジタル化され (Plexon、米国テキサス州ダラス)、スパイク選別のために処理されました。 スパイクのソートは、Klusta (バージョン 3.0.16) を使用した自動スパイク検出とクラスタリング、その後の Kwik GUI (v1.0.9) を使用した手動ソートで構成されていました66。 まず、波形から特定されるノイズアーティファクトを抽出しました。 第 2 に、マルチユニット活動 (MUA) は、自己コレログラムにおける低振幅かつ不応期 (>2 ms) のない波形から決定されました。 3 番目に、自動および相互コレログラムと主成分特徴を使用してクラスターをマージおよび/または分割した後、自己コレログラムに明確な不応期 (>2 ミリ秒) を持つ単一ユニット活動 (SUA)、または MUA が検出されました。決定した。 記録されたニューロンの深さを推定するために、各プローブからの波形の最大振幅が比較され、各 SUA/MUA の最も近いプローブについて決定されました。 MUA 分析には SUA が含まれました (n = 8 匹、MUA 分析では 128 個のプローブ部位が同時に記録されました)。

左のウィスカーパッドのブラッシング（補足図2）、フォン・フライ刺激（補足図5）、およびION結紮中の刺激（補足図8）の電気生理学的データ分析では、生の電気信号が30℃で増幅およびデジタル化されました。 kHz (Open Ephys67、Open Ephys GUI、v0.5.0) に変換され、スパイク ソート用に処理されます。 スパイク ソートは、Kilosort (v2.0、https://github.com/cortex-lab/KiloSort) を使用した自動スパイク検出とクラスタリング、その後の Phy (v2.0b1、https://phy.readthedocs.io/) を使用した手動ソートで構成されていました。 en/最新/)。 POD7 および POD21 での MUA 分析 (補足図 8) では、各記録にわたって同じ 32 チャネル、4 シャンク電極 (Buzsaki32) を使用しました。 次に、Dys と BF の隣接する 2 つのシャンクを選択し、各シャンクから記録されたスパイクの総数を比較しました。

記録後、マウスをペントバルビタールナトリウム（体重１ｋｇ当たり６０ｍｇ、腹腔内）で深く麻酔し、固定液（０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドおよび０．２％ピクリン酸）を経心臓的に灌流した。 脳を取り出し、冠状に切断して５０μｍの切片にした。 切片を VGluT2 に対するモルモットポリクローナル抗体 (モルモット; 1:500、MSFR106290、日東紡メディカル株式会社、東京、日本) と一晩インキュベートし、続いて NeuroTrace 435/455 (1:100; Thermo Fisher Scientific,米国マサチューセッツ州ウォルサム）を調査し、録音場所を特定しました。 画像は、µManager (ver. 1.4、https://micro-manager.org/) を備えた冷却 CCD カメラ (RS 6.1 s、QSI、ケンブリッジ、英国) を備えた正立顕微鏡 (AxioScope.A1、Zeiss、ドイツ) でキャプチャされました。 ）。

S/N を計算して領域または細胞の特性を特定し、有害な熱と触覚刺激に対する選択性を評価しました。 左側のウィスカーパッド上にペルチェ素子（4.2mm×4.0mm）を置き、熱刺激を加えた。 皮膚への熱伝達を確実にするために、ヒゲの間の小さな毛は脱毛フォームによって除去され、ヒゲはそのまま残ります。 有害な熱応答の S/N については、ペルチェ デバイスの 45 ～ 50 °C で 500 ms の応答 (ベージュの陰影、図 1e) が S 応答としてカウントされました。 無害な熱応答（45°Cまでの1000ミリ秒、33〜45°Cに相当、灰色の陰影、図1e）をN応答としてカウントしました。 この定義は、温度コーディング ニューロンを除外することにより、有害な熱選択性ニューロンを選択するのに役立ちました。

触覚刺激の場合、ひげのたわみの開始後 30 ms の反応 (青い矢印、図 2a、右) が S 反応としてカウントされました。 ウィスカーのたわみが始まるまでの 60 ms の応答を N 応答としてカウントしました (図 2a)。 この計算にはすべてのたわみが使用されました (図 2b)。 この定義は、ニューロンが連続的なひげの偏向にどのように反応するかを検出するのに役立ちました68。

機械的痛みに対する刺激として、フォン フライ フィラメント (10 g) を左のひげパッドに適用しました。 皮膚への 10 g フォン フライ フィラメントの適用を検出するために、左側のウィスカー パッド上のすべてのウィスカーとウィスカー間の小さな毛を除去しました。 すべての刺激トライアルは、200 Hz で記録する高速カメラ (XiQ、Ximea GmbH、ミュンスター、ドイツ) によって監視されました。 関心領域をウィスカーパッド上に配置し、皮膚の曲がりを計算しました（補足図5aのカラープロット）。 皮膚の曲げの飽和点により、フォン・フライフィラメントの曲げの開始が特定された。

カプサイシン (和光純薬工業株式会社、大阪、日本) を 100% エタノールおよび 7% Tween 80 の生理食塩水 (10 mM) に溶解しました。 100% エタノール、7% Tween 80、および生理食塩水を含む溶液をビヒクルとして使用しました69。 動物を動物施設からホームケージに移し、２％イソフルランで麻酔した。 カプサイシン（５０μＬ）またはビヒクル（５０μＬ）を左のひげパッドに注射した後、マウスをホームケージに戻し、動物施設に戻した。

注射の 3 時間後、マウスをイソフルラン (2 ～ 3%、5 分間) で深く麻酔し、ヘパリン ナトリウムを含む前固定液 (0.02 M リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4 中の 250 mM スクロースおよび 5 mM MgCl2) を経心臓的に灌流しました。塩 (30 ～ 40 単位/mL)、続いて固定液 (4% パ​​ラホルムアルデヒドおよび 0.2% ピクリン酸を含む 0.1 M リン酸緩衝溶液)。 脳を新しい固定液中で4℃で12〜16時間後固定し、ビブラトーム（VT1000S、Leica Microsystems Inc、Wetzlar、ドイツ）を使用して厚さ40μmの切片に冠状に切断しました。 切片を、c-Fos に対するウサギポリクローナル抗体 (1:2000; 226 003、Synaptic Systems GmbH、ゲッティンゲン、ドイツ)、VGluT2 に対するモルモットポリクローナル抗体 ( 1:500; MSFR106290、日東紡メディカル株式会社、東京、日本）、カルビンジン D-28K に対するヤギポリクローナル抗体（1:500; MSFR100410、日東紡メディカル株式会社）、およびカルビンジン D-28K に対するマウスモノクローナル抗体10% 正常ロバ血清および 0.3% Triton X-100 を含む 0.05 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中の NeuN (1:500; MAB377、Merck、ダルムシュタット、ドイツ)。 PBS で 2 ～ 3 回洗浄した後、切片を Alexa Fluor Plus 555 (c-Fos の場合、1:500; A32794、Thermo Fisher Scientific、Waltham) に結合した二次抗体とともに 20 ～ 25 °C で 2 ～ 3 時間さらにインキュベートしました。 、マサチューセッツ州、米国）、Alexa Fluor 647（VGluT2 の場合、1:500; 706-605-148、Jackson ImmunoResearch、ウェストグローブ、ペンシルバニア州、米国）、Alexa Fluor 488（カルビンジンの場合、1:500; A11055、Thermo Fisher Scientific ）、およびAlexa Fluor Plus 405（NeuNの場合、1:500; A48257、Thermo Fisher Scientific）を、10%の正常ロバ血清および0.3% Triton X-100を含む0.05 M PBSに溶解しました。 0.1 M リン酸緩衝液で 2 ～ 3 回洗浄した後、切片をスライドガラスにマウントし、SlowFade Diamond 退色防止封入剤 (Thermo Fisher Scientific) でシールし、カバースリップをかけました。 画像は蛍光顕微鏡（BZ-X 810、Keyence、東京、日本）を使用して取得しました。 BFおよびDysの各カラムにおけるc-Fos発現細胞の数を手動で数えた。 同じ関心領域内の NeuN 染色ニューロンの数もカウントされました。 手作業による計数は、盲検化された独立した観察者によって行われた。

脳を後固定した後、厚さ50μmのスライスを作成し、交互のスライスをシトクロムcオキシダーゼと反応させてBFを同定し、c-Fos免疫組織化学を行った。 c-Fos 免疫組織化学では、切片をリン酸緩衝液中の 1% H2O2 で処理して内因性ペルオキシダーゼを不活性化し、次に抗 c-Fos 抗体 (1:10000、ウサギ; Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ) とともに 10% 正常溶液でインキュベートしました。 0.3% Triton X-100 を含むリン酸緩衝生理食塩水中のヤギ血清を 4 °C で一晩培養しました。 次に、スライスをビオチン化ヤギ抗ウサギ IgG 抗体 (1:200; Vector Laboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国) とインキュベートし、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体 (ABC キット; Vector Laboratories) と反応させました。 視覚化のために、スライスをDAB溶液(0.02% DAB、トリス緩衝生理食塩水中0.3% 硫酸ニッケルアンモニウム)および1% H2O2中でインキュベートした。 画像は、Olympus DP Manager (ver. 3.1.1.208、Olympus) を使用して、CCD カメラ (DP70; Olympus、東京、日本) を備えた正立顕微鏡で取得しました。 c-Fos を発現するニューロンは、Sobel フィルターによるエッジ検出とそれに続く 2 値化を備えたカスタム作成の MATLAB (MathWorks、Natick、MA、USA) プログラム (補足ソフトウェア 1) を使用して計数されました。 c-Fos 発現細胞の数は、盲検化された独立した観察者によって 3 つのスライスで手動でカウントされました。 この個人は自動カウントには関与しておらず、各層の c-Fos 発現の傾向が地域間で変わらないことを確認しました。

逆行性標識では、固有シグナルイメージング後に Alexa Fluor 555 (0.2%) または Alexa Fluor 488 (1%) と結合したコレラ毒素サブユニット B を適用して、それぞれ Dys と BF を同定しました。 3日後、マウスをペントバルビタールナトリウム(体重1kg当たり60mg、腹腔内)で深く麻酔し、固定液(0.1Mリン酸緩衝液中の4%パラホルムアルデヒドおよび0.2%ピクリン酸)を経心臓的に灌流した。 脳を取り出し、冠状に切断して５０μｍの切片にした。 切片を、VGluT2 に対するモルモットポリクローナル抗体 (1:500; MSFR106290、Nittobo Medical Co., Ltd.、東京、日本) と一晩インキュベートし、続いて NeuroTrace 435/455 (1:100; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,アメリカ合衆国）。

順行性標識の場合、ビオチン化デキストラン アミン (分子量: 10,000、生理食塩水中 10%、Thermo Fisher Scientific) を POm (ブレグマの後方 1.7 mm、正中線の外側 1.3 mm) に注入しました。 7 日後、マウスに深い麻酔をかけ、上記のように脳切片を切り出しました。 切片を VGluT2 抗体 (モルモット; 1:500、MSFR106290、日東紡メディカル株式会社、東京、日本) と一晩インキュベートし、続いて Alexa Fluor 594 結合抗モルモット抗体 (1:500; 706-585- 148、Jackson ImmunoResearch）、Alexa Fluor 488 結合ストレプトアビジン（1:500; S11223、Thermo Fisher Scientific）、続いて NeuroTrace 435/455（1:100; S21479、Thermo Fisher Scientific）を使用しました。

頭部プレート移植の少なくとも 4 日後に、BF からの応答を測定するために固有信号イメージングが実行されました。 上記の「電気生理学的記録」で説明したように、マウスを麻酔した。 呼吸数と心拍数は、30 Hz Web カメラ (C920; Logitech、ローザンヌ、スイス) と動物の背中にある特注の加速度モニターを備えたビデオベースの呼吸モニターを介して監視されました。 固有信号画像は、microDisplay ソフトウェア (ver. 5.2.3.1、Silicon Software GmbH、ドイツ) を使用し、色消しダブレット (Thorlabs) のタンデムレンズを備えた CMOS カメラ (MV1-D1024E-160-CL、Photonfocus、スイス、ラッヘン) で取得しました。 、ニュートン、ニュージャージー州、米国）およびロングパスおよびショートパスフィルター（BLP01-488R-25およびFF01-650/SP-25、米国ニューヨーク州ロチェスターのセムロック）。 フレームは 20 Hz のレートで取得され、フレーム サイズは 600 × 500 ピクセルで、5.5 × 4.5 mm の皮質領域を表しました。 脳表面を緑色 LED (M530L3; Thorlabs) で照明して血管パターンを取得するか、赤色 LED (M617L3; Thorlabs) で照明して固有信号を取得しました。 赤色 LED の輝度は、各イメージング間で一定でした。 麻酔の深さを追跡するために、呼吸数 (70 ～ 120 サイクル/秒) がモニタリングされました。 画像は、歯科用アクリル透明樹脂で覆われた頭蓋骨を通して記録されました。 歯科用アクリル樹脂は、まぶしさを軽減するためにネイルトップコートとシリコーン浸漬油（オリンパス）で覆われました。

触覚刺激としてのひげ刺激は、前述したように圧電デバイスを使用して生成されました68。 触覚刺激に対する皮質の反応を視覚化するために、各フレームの反射率比 (dR/R、ここで dR は刺激開始前に撮影された 20 フレームの平均であるベース画像からの反射率 R の差) を計算しました。 皮質活動の変化をマッピングするために、カスタム作成された MATLAB プログラムを使用して、異なる実験日に撮影された画像が血管パターンに従って位置合わせされました。 母集団分析では、次の方程式を使用して dR/R から Z スコア画像を計算しました。

ここで、SD は標準偏差です。 ブレグマの位置は、動物間の位置合わせに使用されました。

神経障害性疼痛モデルを作成するために、ION を外科用糸 (Vicryl Rapide、Ethicon、ブリッジウォーター、ニュージャージー州、米国) でしっかりと結紮しました。 この糸を使用すると、糸の引張強度が体内で徐々に低下するため（2 ～ 3 週間以内）、神経損傷と回復の両方での BF 活動の変化を観察できます。 引張強度は、神経損傷と回復の段階にそれぞれ対応し、POD7 ではほぼ 50%、POD21 では 0% に減少します。 神経因性疼痛の行動アッセイでは、動物を特注のチューブ ホルダーを備えた 50 mL チューブに入れるように訓練しました。 行動訓練は、左ＩＯＮ結紮または偽手術の少なくとも７日前に、マウスの水へのアクセス（１ｍＬ／日）を制限した後に開始した。 行動実験中、水は 1 日間 1.5 mL に制限されました。 動物たちは水を飲むためにチューブに入り、穴から鼻を突き出したままにするように訓練されました。 動物が水を飲んでいる間、左側のひげパッドを von Frey フィラメント (1.4、2、4、6、8、および 10 g; Ugo Basile、Varese、Italy) によって刺激して、逃避閾値を測定しました 70。 刺激中、視覚情報は黒いカバーによって遮断されました（補足図6）。

ION 結紮の 7 日または 21 日後、および偽手術の 7 日後、マウスを濃縮環境に 1 時間置き、いくつかの物体を探索している間、泡立てを増やしました（補足図 9）40、41。 次に、マウスをピクリン酸を含む 4% パラホルムアルデヒドで灌流した後、上記の DAB プロトコールを使用して c-Fos 免疫組織化学を行った。

まずマウスは、3 ～ 4 日間水の報酬を得るためにチューブに入るように訓練されました。 次に、マウスを頭部に固定し、ホワイトノイズ 71 の下で 3 ～ 4 日間、球形のトレッドミル (Ø 30 cm) 上を自由に走らせました。 この後、左側のひげパッドの IR レーザー刺激に対するマウスの行動を監視しました。 有害な熱刺激に対しては、IR ダイオード レーザー (ウィスカー パッド上で Ø 1 mm、波長 808 nm、SSL-808-1000-10TM-D-LED、Shanghai Sanctity Laser Technology Co., Ltd.、上海、中国)使われた。 刺激持続時間は、皮膚温度を 39 °C または 52 °C に上昇させるために、それぞれ 0.09 および 0.27 J/mm2 に相当する 500 または 1,500 ミリ秒に設定されました43。 各セッションの開始時と終了時に、動物はトレッドミル上で水の報酬を得ましたが、刺激セッション中は得られませんでした。 各セッションはさまざまな刺激条件で構成され、各条件はランダムに選択され、1 セッションで 5 回動物に提示されました。 動物の後ろと両側に設置された 3 台のカメラ (CMOS センサーの IR フィルターは取り外されました、C922、スイス、ローザンヌ) で 30 Hz で画像を撮影し、逃げる方向、速度、移動距離などの行動を記録しました。 、まばたき、左前肢の動き。 これらのパラメータは、各パラメータの関心領域の差をフレームごとに計算することによって分析されました。 これらのパラメーターは、カスタム作成された MATLAB コード (補足ソフトウェア 2) によって動物間の比較のために Z スコアに計算されました。 刺激の開始前に動物がトレッドミル上で走り続けた場合、刺激の効果は隠蔽されました。 これらの動物は、刺激に関係なく走り続ける傾向がありました。 したがって、トライアル間の最大速度に差は観察されず、これらのセッションは分析から除外されました。 Z スコアの計算には少なくとも 2 つのセッションが使用されました。 センサーのホワイトアウトを防ぎ、IR レーザー刺激の正確な位置とサイズを特定するために、ノッチ フィルター (808 nm OD4 ノッチ フィルター、86-702; Edmund Optics) を左側のカメラの前に配置しました。 カスタムメイドの LED 照明器 (940 nm) を各カメラの前に置き、動物を照らしました。

POm から Dys への視床皮質線維を活性化するために、ウイルス (AAV9-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP) を右 POm (ブレグマの尾側 1.7 ～ 1.9 mm、側方 1.2 mm、深さ 2800 および 3000 μm) に注射しました。脳表面; 各深さで 50 nL) (QSI; Stoelting、米国イリノイ州ウッドデール)。 青色レーザー (473 nm; Lasos、ドイツ) を光ファイバーケーブル (Ø 200 μm; Thorlabs) に接続しました。 光ファイバーの出力と皮質の表面は、ファイバーポートと色消しレンズを使用して共役面上に配置されました。 x および y ガルバノ ミラー (ガルバノ スキャニング システム、GVS002; Thorlabs) を無限空間に配置して、刺激の位置を制御しました。 ダイクロイックミラーも無限空間に配置され、反射光は CMOS カメラ (Grasshopper3、Teledyne FLIR、オレゴン州) のセンサー上に焦点を合わせました。 この設計により、刺激部位の正確な位置のモニタリングが可能になりました49。

光チョッパー（パルス幅、2.5 ms、MC2000B; Thorlabs）を使用して、40 Hz パルスで PV 介在ニューロンを活性化しました72。 Dys 活性の抑制効果を調べるために、Dys をカバーする 6 つの位置を、色消しダブレット レンズ (AC254-60-A; Thorlabs) によって脳表面に焦点を合わせた 473 nm レーザーで刺激しました。 刺激部位の中心は 430 μm 離れていました。 出力は 1 箇所あたり 0.9 mW、半径は 0.5 ～ 0.75 mm、結果として 0.51 ～ 1.15 mW/mm2 となり、頭蓋骨を通して光が減衰しました50。 両端のレーザー位置、位置 1 (P1) と P6 は Dys からかなり離れていましたが、P3 と P4 は Dys の中心にありました。 ライトスポットのサイズを考慮すると、P3 と P4 は隣接する足領域と BF 領域を部分的に刺激する可能性があります。

統計は MATLAB (R2018a、9.4.0.813654) を使用して実行されました。 特に断りのない限り、データは平均値±SEMとして表示されます。 代表的な冠状断面を図1a、補足図に示します。 図1b、9b、13a、b、および14a、および図4cおよび補足図7に示す代表的な接線断面を独立して繰り返し、同様の結果が少なくとも3回、または各実験に示される同じ数の動物で繰り返されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付けるすべてのデータは、論文とその補足情報に記載されています。 ソース データ ファイルはこのペーパーに付属しています。 リクエストに応じて、あらゆるデータを著者から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

データの分析または表示に使用されるすべてのコンピューター コードは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

岩村裕也、階層的体性感覚処理。 カー。 意見。 ニューロビオール。 8、522–528 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Penfield, W. & Boldrey, E. 電気刺激によって研究された人間の大脳皮質における体性運動と感覚表現。 Brain 60、389–443 (1937)。

記事 Google Scholar

バージニア州アプカリアン、CM ブッシュネル、管理栄養士ツリーデ & ズビエタ、J.-K. 健康と病気における痛みの知覚と調節に関する人間の脳のメカニズム。 ユーロ。 J.ペイン。 9、463–463 (2005)。

論文 PubMed Google Scholar

Kenshalo, DR & Isensee, O. 有害な刺激に対する霊長類のSI皮質ニューロンの反応。 J. Neurophysiol. 50、1479–1496 (1983)。

論文 PubMed Google Scholar

ブッシュネル、MC et al. 痛みの知覚: 一次体性感覚皮質には役割がありますか? 手順国立アカド。 科学。 96、7705–7709 (1999)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Wimmer, VC、Bruno, RM、de Kock, CPJ、Kuner, T. & Sakmann, B. 投射柱の寸法と、ラットの振動皮質における VPM および POm 軸索の構造。 セレブ。 Cortex 20、2265–2276 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, LM、Friedman, RM & Roe, AW リスザルの仙腸野皮質内の機械的侵害刺激の領域特異的表現。 痛み 141、258–268 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Vierck、CJ、Whitsel、BL、Favorov、OV、Brown、AW、Tommerdahl、M. 痛みのコーディングにおける一次体性感覚皮質の役割。 PAIN® 154、334–344 (2013)。

記事 Google Scholar

Treede、R.-D.、Kenshalo、DR、Gracely、RH、および Jones、AKP 痛みの皮質表現。 痛み 79、105–111 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hofbauer, RK、Rainville, P.、Duncan, GH & Bushnell, CM 痛みの感覚次元の皮質表現。 J. Neurophysiol. 86、402–411 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Frangeul、L.ら。 侵害受容中のパラレムニスカル経路の特異的活性化。 ユーロ。 J. Neurosci. 39、1455–1464 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

江藤和也ほか一次体性感覚皮質の活性増強が前帯状皮質に領域間で寄与すると、慢性疼痛行動が加速する。 J. Neurosci. 31、7631–7636 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シン、A.ら。 感覚痛経路と情動痛覚経路の皮質統合のマッピング。 カー。 バイオル。 https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.02.091 (2020)。

カストロ、A.ら。 三叉神経尾核の侵害受容の皮質調節。 J. Neurosci. 37、11431–11440 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu、Y.ら。 接触および触覚の神経障害性疼痛の感度は、皮質脊髄突起によって設定されます。 ネイチャー 561、547–550 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Koralek, K.-A.、Jensen, KF & Killackey, HP ラットの体性感覚皮質への視床入力の 2 つの相補的パターンの証拠。 脳解像度 463、346–351 (1988)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Petersen、CCH げっ歯類のバレル皮質における感覚運動処理。 ナット。 神経科学牧師。 20、533–546 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kleinfeld, D. & Deschê​​nes, M. ビブリッサ走査感覚運動システムにおける物体位置の神経基盤。 ニューロン 72、455–468 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Estebanez, L.、Férézou, I.、Ego-Stengel, V. & Shulz, DE げっ歯類のバレル皮質における触覚シーンの表現。 神経科学 368、81–94 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chapin, JK & Lin, CS 麻酔をかけたラットと覚醒したラットのSI皮質における身体表現のマッピング。 Ｊ．比較。 ニューロール。 229、https://doi.org/10.1002/cne.902290206 (1984)。

Welker, W.、Sanderson, KJ & Shambes, GM アルビノラットの体性感覚運動大脳皮質の移行ゾーンへの求心性投射のパターン。 脳解像度 292、261–267 (1984)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lamour, Y.、Guilbaud, G.、および Willer, JC ラットの体性感覚 (SmI) 皮質: II。 有害および非有害な入力の層状および柱状組織。 経験値脳解像度 49、46–54 (1983)。

CAS PubMed Google Scholar

Sun、JJ、Yang、JW、Syu、BC ラットの一次体性感覚皮質におけるレーザー熱誘発皮質内電場電位の電流源密度分析。 神経科学 140、1321–1336 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ハサボフ、SG et al. ラットのかゆみと痛みを引き起こす刺激に対する一次体性感覚皮質のニューロンの反応。 J. Neurophysiol. https://doi.org/10.1152/jn.00038.2020 (2020)。

ファヴォロフ、OV et al. ラットの感覚運動野の移行帯（TZ）にある侵害反応領域が新たに同定された。 脳解像度 https://doi.org/10.1016/j.brainres.2019.04.028 (2019)。

Kallioma¨ki, J.、Weng, H.-R.、Nilsson, H.-JR および Schouenborg, J. 一次体性感覚皮質 (SI) への侵害受容 C 線維入力。 ラットにおける電場電位研究。 脳解像度 622、262–270 (1993)。

記事 Google Scholar

Kim, U. & Lee, T. 深部体性入力を処理するラット一次体性感覚皮質の顆粒異常領域で生じる領域内および皮質皮質回路。 J.コンプ。 ニューロール。 521、2585–2601 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bokiniec, P.、Zampieri, N.、Lewin, GR & Poulet、JFA 熱知覚の神経回路。 カー。 意見。 ニューロビオール。 52、98–106 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

パリシオ・モンテシノス、R. et al. 暖かい知覚の感覚コーディング。 ニューロン。 https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.02.035 (2020)。

バージニア州アプカリアン、RA ステア、SJ ボラノフスキー 熱誘発性疼痛により振動触覚が減少する: タッチゲート。 体性感覚。 モト。 解像度 11、259–267 (2009)。

記事 Google Scholar

Adamczyk, WM、Saulicz, O.、Saulicz, E. & Luedtke, K. 急性侵害受容性腰痛における触覚鋭敏（障害）機能。 痛み 159、427–436 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Moisset, X. & Bouhassira, D. 神経因性疼痛の脳画像処理。 NeuroImage 37、https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2007.03.054 (2007)。

岡田 哲 ほか痛みは体性感覚皮質の安定した活性な微小回路を誘導し、治療標的を提供します。 科学。 上級 7、https://doi.org/10.1126/sciadv.abd8261 (2021)。

Kim, S.、Eto, K. & Nabeakura, J. 慢性疼痛時のマウス体性感覚皮質におけるシナプスの構造と機能: in vivo 二光子イメージング。 神経可塑性 2012、640259 (2012)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

石川 哲 他皮質星状細胞は、脊椎の可塑性と鏡像的な痛みの誘発を刺激します。 痛み 159、1592–1606 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

竹内裕子、大崎博、矢ヶ崎裕子、片山裕子、宮田正人 脳内の体性局所再構成と末梢感覚後の異所性機械過敏症の神経基盤としてのマウスの体性感覚視床における求心性線維リモデリング神経損傷。 eNeuro 4、https://doi.org/10.1523/ENEURO.0345-16.2017 (2017)。

南雲 裕也 ほか強壮性GABA作動性阻害は、体性感覚視床および異所性感覚における神経損傷誘発性の求心性リモデリングに不可欠です。 Cell Rep. 31、107797 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

植田Y. & 宮田M. 脳幹の局所ミクログリアは、末梢神経損傷後の視床におけるひげマップの可塑性を誘導します。 Cell Rep. 34、108823 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シション、J.、ブランク、TJJ、ガン、W.-B. & Yang, G. 皮質ソマトスタチン介在ニューロンの活性化は、神経障害性疼痛の発症を防ぎます。 ナット。 神経科学。 20、1122–1132 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スタイガー、JF et al. 興奮性ニューロンと抑制性ニューロンは、新しい環境を探索した後、バレル関連カラムで c-Fos を発現します。 神経科学 109、687–699 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bisler, S. et al. ラットのひげからバレルへの経路におけるc-Fos、ICER、Krox-24およびJunBの発現：豊かな環境の触覚探索によるひげ刺激時の誘導の時間経過。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． ニューロアナト。 23、187–198 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Dombeck, DA、Khabbaz, AN、Collman, F.、Adelman, TL & Tank, DW 覚醒した移動マウスにおける細胞分解能による大規模な神経活動のイメージング。 ニューロン 56、43–57 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Plaghki, L. & Mouraux, A. 高出力赤外線レーザーで皮膚侵害受容器を選択的に活性化するにはどうすればよいでしょうか? レーザー刺激の生理学と生物物理学。 神経生理学クリニック/クリニック神経生理学。 33、269–277 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

Cho, C. et al. しかめっ面スケールを使用したマウスの開頭術後の鎮痛効果と投与経路の評価。 科学。 議員9, 359 (2019)。

論文 PubMed PubMed Central ADS CAS Google Scholar

Deuis、JR、Dvorakova、LS、Vetter、I. 齧歯動物の疼痛行動を評価するために使用される方法。 フロント。 モル。 神経科学。 10、284 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ラングフォード、DJ 他実験用マウスの痛みの表情のコーディング。 ナット。 方法 7、447–449 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

McCormick, DA、Steinmetz, JE & Thompson, RF 下オリーブ複合体の病変は、古典的に条件づけられたまばたき反応の消滅を引き起こします。 脳解像度 359、120–130 (1985)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zatka-Haas, P.、Steinmetz, NA、Carandini, M. & Harris, KD 感覚コーディングと視覚的決定におけるマウス皮質の因果的影響。 eLife 10、https://doi.org/10.7554/elife.63163 (2021)。

佐藤、TR 他マウス前頭皮質における眼球運動関連活動の半球間の動的表現。 eLife 8、https://doi.org/10.7554/elife.50855 (2019)。

Guo、ZV et al. マウスの触覚決定の基礎となる皮質活動の流れ。 ニューロン 81、179–194 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

乾 和人、辻 哲也、柿木 隆、ヒトにおける触覚刺激による鎮痛機構の時間的解析。 セレブ。 Cortex 16、355–365 (2006)。

論文 PubMed Google Scholar

プロナー、M.、シュミッツ、F.、フロイント、H.-J. & Schnitzler、A. 人間の痛みの処理における一次体性感覚皮質と二次体性感覚皮質の並行活性化。 J. Neurophysiol. 81、3100–3104 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ガウリオ、C. & バーナード、J.-F. ラットの後部三角視床ニューロンは、二次体性感覚と島皮質に侵害受容メッセージを伝達します。 J. Neurosci. 24、752–761 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pouchelon, G. et al. モダリティ固有の視床皮質入力は、シナプス後 L4 ニューロンの正体を指示します。 ネイチャー 511、471 (2014)。

論文 CAS PubMed ADS Google Scholar

Petreanu, L.、Mao, T.、Sternson, SM & Svoboda, K. 新皮質の興奮性結合の細胞内組織。 Nature 457、1142–1145 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Lee, T. & Kim, U. 深部体性入力を処理するラット一次体性感覚皮質の顆粒異常帯からの下降投影。 J.コンプ。 ニューロール。 520、1021–1046 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

Whitsel, BL、Vierck, CJ、Waters, RS、Tommerdahl, M. & Favorov, OV 正常および異常な体性感覚知覚に対する侵害反応性領域 3a の貢献。 J.ペイン。 https://doi.org/10.1016/j.jpain.2018.08.009 (2018)。

Chen, L. 痛みと接触の皮質表現: 非ヒト霊長類における機能的神経画像化と電気生理学を組み合わせた証拠。 神経科学。 ブル。 34、165–177 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

岩村洋、田中正、坂本正、彦坂央。意識のあるサルの第一体性感覚皮質の領域 3 の異なる指領域を表す機能的細分。 経験値脳解像度 51、315–326 (1983)。

Google スカラー

Cooke, DF、Padberg, J.、Zahner, T. & Krubitzer, L. リスの運動皮質の機能組織と皮質接続。 セレブ。 コーテックス 22、1959 ～ 1978 年 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

パンチュエロ、RM 他 BA3a: BA3c 内の人間の体性感覚皮質の侵害反応性の特定の領域 NeuroImage、117187、https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2020.117187 (2020)。

Geyer, S.、Schleicher, A. & Zilles, K. 人間の一次体性感覚皮質の領域 3a、3b、および 1 1. 微細構造組織と個人差。 NeuroImage 10、63–83 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Niell, CM & Stryker, MP マウスの視覚野における高度に選択的な受容野。 J. Neurosci. 28、7520–7536 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Borges, M. & Antognini, JF 脳はイソフルラン麻酔中の有害な刺激に対する体性反応に影響を与えますか? 麻酔学 81、1511–1515 (1994)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

高島 I.、梶原 R.、飯島 T. ラットの体性感覚皮質における硝子体間毛皮誘発活動の電位感受性色素イメージング。 神経科学。 レット。 381、258–263 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロサント、C.ら。 大型で高密度の電極アレイのスパイク選別。 ナット。 神経科学。 19、634–641 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シーグル、JH et al. Open Ephys: マルチチャネル電気生理学のためのオープンソースのプラグインベースのプラットフォーム。 J. Neural Eng. 14、45003 (2017)。

記事 Google Scholar

福井 明 ほか運動皮質梗塞後の一次体性感覚皮質における層特異的な感覚処理障害。 科学。 議員 10、3771 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Noma, N. et al. ラットの口腔および頭蓋顔面領域へのカプサイシン注射後の三叉神経脊髄路尾核および上部頸髄における pERK 免疫反応性細胞の組織化。 J.コンプ。 ニューロール。 507、1428–1440 (2008)。

論文 PubMed Google Scholar

北川淳 他末梢単神経障害ラットにおける三叉神経の一次求心性活動の調節に関与するメカニズム。 ユーロ。 J. Neurosci. 24、1976 ～ 1986 年 (2006)。

論文 PubMed Google Scholar

Hu、L.ら。 痛みや音はありましたか？ 感覚感度の種間のばらつき。 痛み 156、2449–2457 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Cardin, JA et al. 高速スパイク細胞を駆動すると、ガンマリズムが誘発され、感覚反応が制御されます。 Nature 459, 663 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

素晴らしい技術支援をしていただいた関野幸恵さんと谷由美さんに感謝いたします。 この研究は、JSPS 科研費助成番号 JP15K21387、JP17H05912、JP18K14854、JP21K07285 および上原記念財団からの支援を受けました。この研究は、JSPS 科研費助成番号 JP20H05481、JP20H05916、JP20K21508、JP17H05752、JP15H01 によっても部分的に支援されました。 667、資生会奨学金基金医科学基礎研究者 渡邉恵子 MM 賞、JSPS 科研費 JP21K06444 YU および日本医療研究開発機構 AMED による疾患研究のための統合神経技術（脳/MINDS）による脳マッピングプログラム番号JP19dm0207057。

Hironobu Osaki

現住所：同志社大学大学院脳科学研究科脳機能回路構築研究室（京都府京田辺市）

東京女子医科大学大学院医学系研究科生理学教室神経生理学分野

Hironobu Osaki, Moeko Kanaya, Yoshifumi Ueta & Mariko Miyata

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

HO と MM が実験を設計しました。 HO、MK、YU が実験を実行し、データを分析しました。 HO と MM が原案を書きました。

Correspondence to Hironobu Osaki or Mariko Miyata.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Jochen Staiger、Oleg Favorov、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

大崎 洋、金谷 正、植田 裕 他マウス体性感覚皮質の顆粒異常領域およびバレル領域における独特の侵害受容処理。 Nat Commun 13、3622 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-31272-w

引用をダウンロード

受信日: 2021 年 3 月 25 日

受理日: 2022 年 6 月 7 日

公開日: 2022 年 6 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31272-w

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。